Millipore跻身反义行列

看来,Millipore Corp.(Bedford,MA)象它的对手Applied Biosystems Inc.(Foster City,CA)一样,指望利用DNA合成仪大量生产反义药物。作为开发工作的一部分,它已与ISIS Pharmacentieals,Inc.(Carlsbad,CA)签署一项非排它性合作协议,为ISIS生产大量寡核苷酸反义药物。“我们的好处是明摆着的”,ISIS常务副总裁Dan Kisner说,“我们将利用Millipore的设备与技术”。作为回报,“Millipore想让自己的设备更趋完美,以期能够大规模生产寡核苷酸并销售出去”。     

靶向Survivin的反义寡核苷酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用

 Survivin是新近克隆的一种凋亡抑制蛋白 (IAP)家族成员 ,在几乎所有肿瘤组织中特异性表达 ,而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达 .采用四唑盐 (MTT)比色实验法比较 2 0条抗人survivin反义寡核苷酸对HeLa细胞增殖的抑制效果 ,并从中筛选效果显著的反义寡核苷酸 ,在体外水平进一步验证其抑制survivin表达的能力 .在用 4 0 0nmol L反义寡核苷酸转染HeLa细胞 4 8h后 ,有 4条反义寡核苷酸对细胞增殖的抑制率超过 4 0 %,其中 4 5号反义寡核苷酸的抑制率可达5 9%,而阳性对照序列ISIS2 372 2的抑制率仅达 30 %.Northern和Western印迹分析证明 :4 5号反义寡核苷酸可明显降低细胞中survivin基因的mRNA含量和蛋白水平 .4 5号反义寡核苷酸还可在较低浓度 (2 0 0nmol L)显著增强HeLa细胞对化疗药三尖杉酯碱的敏感性 .因此 ,4 5号反义寡核苷酸有望应用于survivin高表达肿瘤的辅助治疗之中     

Ciba-Geigy与ISIS共同开发反义技术

Ciba-Geigy Ltd.(Basel,Switzerland)和ISIS药品公司已决定共同开发反义技术.Ciba-Geigy将出资3千万美元,双方共同参与研究.由于这笔投资,Ciba-Geigy将获得除美国以外的,世界范围的该项目产品销售权,在美国它也希望有所建树.     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

新的改进的反义药物即将问世

反义药物就要从理论变成现实了吗?由于定靶和降解困难以及亲和性低,反义寡核苷酸仍不能用于治疗。然而,某些工业人士说,多亏了反义寡核苷酸研究的最新进展,这一状况就要改变了。研究人员试图使人造的单链DNA选择性地结合RNA,从而阻止那些不想要的蛋白的生成。 Gilead Sciences,Inc(Foster City,CA)提供了一种技术,能提高反义药物对其RNA靶子的亲和性。方法很简单,就是在反义化合物的T和C碱基上加一个丙炔基团。这样处理得到的寡核苷酸对RNA的亲和力比标准反义分子大10～100倍。这种丙炔“兰”不作用于A和G碱基,有报道说,Gilead正在解决这一问题。     

Fas基因mRNA反义靶点筛选和体外验证

应用PARASS(poly-A anchored RNA accessible sites screening) 技术筛选Fas基因mRNA 获得3个潜在反义作用靶点,靶点1、2、3分别位于Fas基因297nt-317nt、619nt-639nt和662nt-682nt。设计了对应靶点的反义寡核苷酸A1、A2、A3,和10-23型DNAzyme D1、D2和D3。将反义寡核苷酸和Fas基因RNA结合再加入RNase H进行反应,10-23型DNAzyme则直接与Fas基因RNA作用,结果表明：3个靶点的反义寡核苷酸组及DNAzyme均能降解Fas基因RNA,为有效靶点,其靶点反应优势次序为靶点3>靶点1>靶点2;而非靶点对照组和有效靶点突变了2个碱基的对照组均没有反应。靶点2和靶点3与ISIS公司经过多次实验筛选到的Fas反义作用靶点位置基本相同,表明PARASS技术的有效性和可靠性。获得的有效反义寡核苷酸和DNAzyme为后续研究打下基础。     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制（英文）

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

Hybridon对反义技术的开发

反义产品是热门领域,Hybridon Inc.(Worcester.MA)则为该领域的最新一员.公司由Paul Zamecnik组建,拥有抗艾滋病反义技术专利,一种抗艾滋病化合物(已证实离体活性)的专利以及这些新药的开发技术的专利, 总裁Nigel Webb认为,在就该技术的开发而言,公司的明显优势在于拥有生产一组10～30单位长的寡聚反义因子的专有技术.产物半衰期达数日,其成本之低,即使用于     

Calgene公司的遗传工程反义植株获美国专利

这项专利保护该公司对工程番茄植株(产生的果实明显地延长了货架寿命)的所有权。这是将反义技术用于遗传工程植株方面的首项专利。公司已宣布,该专利成功地利用反义重组DNA技术,明显降低了一般番茄中所含的聚半乳糖醛酸酶(PG)的含量,这种酶能使成熟番茄软化。Calgene声称,这项技术使工程植株具有“反义PG”基因,因此这种酶的产量明显降低。反义PG番茄是由Calgene完成的。由Campbell Soup公司提供资金予以协作,这家公司拥有世界范围内的番茄植株销售权,且是Calgene在利用生物技术发展番茄产品方面     

Calgene获得反义植物专利

Calgene 获得了第一个在基因工程植物中使用反义技术的专利。专利号4,801,540保护延伸开的种植架生产水果的专有西红柿植物。Calgene 以前宣布,该公司已成功地利用反义重组 DNA 技术减少与成熟果实软化有关普通西红柿酶(多聚半乳糖醛酸酶或 PG)的存在。该公司的技术涉及到用“反义 PG”基因的工程植物以便极大地减少该酶的产生。反义西红柿是由该公司与 Campbell Soup 公司合作投资开发的。Campbell Soup 公司拥有世界西红柿权,且是     

Ⅰ组mGluRs反义寡核苷酸抗谷氨酸对小鼠大脑皮层神经元的兴奋毒作用

目的研究Ⅰ组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)反义寡核苷酸对谷氨酸钠(Glu)引起的小鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用.方法以细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出、光镜下细胞形态变化为指标,观察培养液中加入Glu引起的神经元损伤及mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸的保护作用;用免疫细胞化学检测神经元mGlulα仪和mGluR5表达.结果实验显示0.1 mmol·L-1的谷氨酸钠可明显造成神经元损伤,使LDH漏出增加(P＜0.01),mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸6 μmol·L-1和8μmol·L-1可明显拮抗Glu引起的神经元损伤,使LDH漏出显著减少(P＜0.01);免疫组化实验证实体外培养神经元mGluRlα和mGluR5阳性表达.结论mGluRl反义寡核苷酸和mGluR5反义寡核苷酸可对抗Glu引起的皮层神经元损伤.     

I组mGluRs反义寡核苷酸抗谷氨酸对小鼠大脑皮层神经元的兴奋毒作用

目的:研究I组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)反义寡核苷酸对谷氨酸钠(Glu)引起的小鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用。方法:以细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出、光镜下细胞形态变化为指标,观察培养液中加入Glu引起的神经元损伤及mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸的保护作用;用免疫细胞化学检测神经元mGlulα仪和mGluR5表达。结果:实验显示0.1mmol.L-1的谷氨酸钠可明显造成神经元损伤,使LDH漏出增加(P<0.01),mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸6μmol.L-1和8μmol.L-1可明显拮抗Glu引起的神经元损伤,使LDH漏出显著减少(P<0.01);免疫组化实验证实体外培养神经元mGluRlα和mGluR5阳性表达。结论:mGluRl反义寡核苷酸和mGluR5反义寡核苷酸可对抗Glu引起的皮层神经元损伤。     

Isis与日本合作研究丙型肝炎反义疗法

Isis Pharmaceuticals,Inc.(Carlsbad,CA)与二个日本组织鉴定了大规模的研究与开发协议。日本方面获得该项抗丙型肝炎反义寡核苷酸研究的经费、主要收入和除日本地区外的世界范围的产品销售权(涉及研究结果)。这二个日本组织,The Chem-Sero-Therapeutic Research Institute(Kumamoto,Japan)     

吗啉反义寡核苷酸在基因功能研究中的应用

吗啉反义寡核苷酸属于第三代反义寡核苷酸,主要通过阻断mRNA的剪接过程来抑制目的基因的功能。吗啉反义寡核苷酸技术现已广泛应用于发育过程中基因功能的研究;鉴于吗啉反义寡核苷酸能与病毒特异mRNA结合,形成的双链物可有效阻断病毒RNA的转录,从而抑制病毒的复制,所以该技术已应用于医学研究,如治疗病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合症等疾病。主要阐述了吗啉反义寡核苷酸的结构特点、作用机制、与其它反义技术的比较,以及该技术的应用与展望。     

首例rDNA花卉今夏在澳大利亚露面

Florigene Australia公司计划市场考查一种重组麝香石竹花,这种花比非转基因品种维持的时间长1倍。FlorigeneB.V(Rijnsburg,The Netherlands)的Theo Aanhane说,这是第一种上市的重组花卉。 Florigene Australia,前身是Calgene Pacific公司,所采用的技术类似于Calgene Ine(Davis,CA)和DNA Plant Technology Corp.(DNAp)用于延长重组番茄货架期的技术。通过抑制乙烯的生成,番茄的成熟被推迟了,Florigene也是用这种方法防止石竹凋残。Aanhane说,反义操作     

Calgene成功地保护了Flavr Savr技术但却放弃了这种番茄

Gralgene Inc.(Davis,CA)打赢了与Enzo Biochem(New York,NY)就反义技术展开的专利官司。Calgene曾用这种技术培育其货架期延长的Flavr Savr~(R)番茄。然而,就在宣告胜利的同时,Calgene却承认这一产品是一次商业上的失败。 Calgene的首席执行官Roger Salquist将这次专利战胜利作为宣告Flavr Savr生产已“大幅度削减”的良机,以便公司能着手评价新的转基因番茄变种。Salquist说,“我们期待着这些新品种,到了成批生产的时候,     

绿色荧光蛋白基因mRNA反义寡核苷酸的筛选和应用

基因mRNA的靶点筛选是设计反义寡核苷酸的关键.建立了PARASS(polyAanchoredRNAaccessiblesitesscreening)方法,即通过在mRNA末端引入polyA,与生物素标记的polyT退火结合,将其同链亲和素磁珠混合,使mRNA通过3’末端得到固定,保持mRNA的自然伸展和折叠,与寡核苷酸文库杂交筛选mRNA的结合靶点.PARASS筛选获得了绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的3个反义寡核苷酸结合靶点,据其设计了多条反义寡核苷酸,与对照组相比,体外RNaseH分析显示3个靶点均为有效,在HeLa细胞内针对靶点的反义寡核苷酸能抑制GFP的表达,得到了Northern印迹结果支持.PARASS对反义寡核苷酸药物设计具有应用价值.     

反义抗肿瘤药准备进入临床试验

有关寡核苷酸药物的最新进展是:一所医学专科学校,已申请用其反义化合物,对白血病患者进行试验。在过去几年间,少数生物技术公司及类似的制药公司投资数百万美元研制能通过与mRNA结合阻断专性基因表达的寡核苷酸。尽管使细胞数减少且极昴贵(每克为几万美元),一些研究者预测,十年内它将成为常规临床用药。随着美国食品和药物管理局(FDA)对有关规定的放松和允许进入预临床阶段反义药物的增加,上述预测将成为现实。     

抑制核转录因子PPARα的反义寡核苷酸的抗乙型肝炎病毒活性研究

目的:研究靶向过氧化物酶体增殖活化受体α(PPARα)的寡核苷酸是否具有抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的活性作用。方法:反义寡核苷酸作用于能稳定表达HBV丹氏颗粒的HepG2.2.15细胞,ELISA检测细胞上清中HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg)的分泌;实时荧光定量PCR考察反义寡核苷酸对HBV DNA复制水平的影响;通过反转录PCR和Western印迹考察反义寡核苷酸作用于细胞后靶基因及靶蛋白的差异表达情况。结果:抑制PPARα表达的反义序列PPARα-2可剂量依赖且特异性地抑制肝癌细胞中HBsAg和HBeAg的表达,且显著降低细胞中PPARαmRNA水平和蛋白水平。结论:通过筛选初步确定了基于PPARα设计的反义寡核苷酸有较好的抗HBV活性,同时也验证确定了PPARα可能成为抗HBV药物的新型作用靶点。