特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉（Humicola insolerts）H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。     

特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达*

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

Expression of Humicola insolens (NC3) endo-β-glucanase Ⅱgene in Pichia pastoris and anylysis of enzymic properties

[目的]在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究.[方法]利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ的cDNA.将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115.[结果]SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达.重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70℃,且在65℃以下具有较好的热稳定性.最适反应pH为6.5,在pH 6.0-7.0之间有较好的稳定性.[结论]用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础.     

产外切葡聚糖酶真菌的筛选鉴定及毕赤酵母中的表达

【目的】外切葡聚糖酶是纤维素酶组分中一类对结晶纤维素有降解作用的酶类,如何提高外切葡聚糖酶活力是研究的关键问题。【方法】从筛选鉴定得到的一株产外切葡聚糖酶酶活较高的黑曲霉Asp-524菌株出发,通过PCR技术克隆得到外切葡聚糖酶基因序列,生物学信息分析后,构建了毕赤酵母诱导型表达载体,实现了该基因在毕赤酵母中的成功表达。【结果】抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导5 d后,酶活达到4.74 U/mL。酶学性质分析显示重组外切葡聚糖酶最适pH为5.0,pH稳定性分析显示在pH为4.0-6.0范围内相对稳定,酶活能保持在最高酶活力的80%以上,最适反应温度为50°C,经60°C保温1 h后,酶活仍能保持80%以上。【结论】结果说明该外切葡聚糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,这一研究为纤维素酶的实际应用奠定了一定基础。     

高密度发酵P.pastoris诱导表达葡聚糖外切酶

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBH Ⅱ酶.方法:PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因.将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌.重组CBH Ⅱ酶的生产是在50 L生物反应器中进行.连续24h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后用甲醇诱导表达64h.结果:放罐时生物量为A600=180,重组CBHⅡ产量为80mg/L.表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性.结论:实现应用pAOX1表达系统在生物反应器中高密度发酵P.pastoris诱导表达CBH Ⅱ.该研究为重组CBH Ⅱ的规模化生产打下基础.     

外切菊粉酶的酶学研究进展

菊粉富含于菊芋、菊苣等多种菊科植物中,是一种来源丰富的可再生资源。菊粉是一种由D 呋喃果糖经β-2, 1-糖苷键连接,还原端经α-1, 2-糖苷键连接1个葡萄糖残基构成的果聚糖。菊粉能被菊粉酶水解,生产果糖、高果糖浆、菊粉寡糖,可通过微生物发酵生产燃料酒精等产品,在食品、生物能源、医疗保健等方面都有重要应用,受到广泛关注。介绍外切菊粉酶的分类、来源、结构和催化机理,重点总结近10年微生物来源外切菊粉酶的重组表达和酶学性质情况,简述外切菊粉酶在食品、能源等方面的应用,展望外切菊粉酶的研究热点及方向。     

真菌漆酶异源表达研究进展

由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物,具有广泛的底物特异性,因此在纸浆漂白、纺织品染料脱色、有毒废弃物的去除、生物修复和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是缺少大量廉价的酶源供应阻碍了漆酶商业化的应用,解决这个问题的一个主要方法就是通过漆酶的异源表达来获得大量的漆酶。综述了真菌漆酶在酵母表达系统和丝状真菌表达系统中表达的研究结果,着重总结了影响漆酶异源表达的因素和提高漆酶表达的策略。     

栓菌420漆酶同工酶B基因克隆及异源表达

根据铜结合区的保守氨基酸序列设计简并引物,扩增栓菌420(Trametessp.420)基因组,结合长距离反向PCR(LD-IPCR)技术,克隆得到新型漆酶同工酶B基因(lacB),包括结构基因(2255bp)及5′-和3′-非编码序列。lacB含12个内含子,其cDNA序列长1560bp,编码495aa成熟多肽和24aa信号肽。lacB与其它不同来源的真菌漆酶基因具有较高的同源性,而与植物、细菌、昆虫的漆酶基因同源性低于25%。将不含信号序列的lacBcDNA通过质粒pPIC9克隆到表达载体pPIC9K上,电击转化毕赤酵母GS115细胞,经BMM-ABTS平板筛选得到漆酶分泌阳性转化子。     

一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质

从马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）DSM5418中克隆出外切菊粉酶（INU）的成熟肽编码区域,在毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115中实现了高效分泌表达,体积酶活力达到15．27U／mL,进一步对重组酶进行了纯化与表征。经过（NH4）2SO4沉淀、透析和分子筛过滤后,得到了纯度大于95％的纯化重组酶,SDS-PAGE分析发现INU的表观相对分子质量为9．0×10^4,大于理论预测值6．0×10^4。纯化酶液的表征结果表明,INU的最适温度和最适pH分别为55℃和5．0,在此条件下INU对菊粉的K。值和比酶活分别为1．90mmol／L和433．86U／mg,对蔗糖的K。值和比酶活分别为27．81mmol/L和1249．49U／mg,I/S值为0．34;HPLC分析表明,INU酶解菊粉的产物由果糖和葡萄糖组成;金属离子Mn2＋、Fe3｜、K｜和Co2＋对酶有促进作用,而Zn2＋、Cu2＋、Ni2＋、SDS和EDTA对酶活力有不同程度的抑制作用。     

特异腐质霉纤维素酶的分离纯化与性质

特异腐质霉Humicola insolens(YH-8)能高效合成高稳定性的纤维素酶.由该菌株所产的纤维素酶粗液经过1.5倍酒精沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析,SephadexG-100凝胶过滤,得到电泳纯的纤维素酶组分一个.对这个组分的催化性质(以羧甲基纤维素为底物)进行了研究,该酶的最适催化温度60℃,pH值为5.5,在50℃以下酶的稳定性较好,70℃条件下底物对酶有较强的保护作用,该酶的pH稳定性范围为4～8,zn2 ,ca2 ,Mg2 ,K ,Li 对酶活有促进作用,Mn2 、Co2 、Fe2 、Fe2 对酶活起抑制作用,酶对CMC-Na和水杨素有分解作用,而不分解脱脂棉和滤纸.     

产中性纤维素酶特异腐质霉H31-3复合诱变研究

中性纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业均具有广泛的应用。采用离子束注入技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉（Humicola insolens）H31-3进行诱变,经发酵筛选获得较高酶活力且传代稳定的正突变菌株H14,制备其原生质体后进行紫外诱变。筛选后得到正突变菌株H14．2,最终CMC酶、滤纸酶活力分别达82．56IU／mL和5．77IU／mL,较原始菌株提高了78．57％和106．81％。     

Gene Cloning of Cellobiohydrolase II from the White Rot Fungus Irpex lacteus MC-2 and Its Expression in Pichia pastoris

A gene (cel4) coding for a cellobiohydrolase II (Ex-4) was isolated from the white rot basidiomycete, Irpex lacteus strain MC-2. The cel4 ORF was composed of 452 amino acid residues and was interrupted by eight introns. Its deduced amino acid sequence revealed a multi domain structure composed of a cellulose-binding domain, a linker, and a catalytic domain belonging to family 6 of glycosyl hydrolases, from the N-terminus. cel4 cDNA was successfully expressed in the yeast Pichia pastoris. Recombinant Ex-4 showed endo-processive degrading activity towards cellulosic substrates, and a synergistic effect in the degradation of Avicel was observed when the enzyme acted together with either cellobiohydrolase I (Ex-1) or endoglucanase (En-1) produced by I. lacteus MC-2.     

Cloning and expression of endo-β-glucanase II gene in Humicola insolens H31-3

Endo-β-glucanase Ⅱ (EG Ⅱ) gene cDNA was isolated from the fungus Humicola insolens H31-3 by RT-PCR.It was cloned into the expression vector pGAPZαA.The resultant recombinant plasmid was introduced into Pichia pastoris GS115 by electroporation after being lin-earized by BspHI digestion.The recombinant Pichia pas-toris strain was obtained and SDS-PAGE showed that the molecular weight of the expression protein was about 55 kD.The cultivation condition and the characteristics of the recombinant EG Ⅱ were also explored.     

来源于Penicillium sp.C1的水产用中性植酸酶基因在毕赤酵母中的表达及性质研究

通过简并引物和TAIL-PCR技术从青霉Penicillium sp. C1菌株的基因组DNA中克隆得到一个新的植酸酶基因,命名为phyC1。其结构基因全长1 477 bp,5’端包含58 bp的内含子序列,该基因编码472个氨基酸和一个终止密码子,前23个氨基酸为信号肽。将PhyC1的成熟蛋白的编码基因在毕赤酵母菌GS115中高效分泌表达,重组蛋白经硫酸铵沉淀和阴离子交换柱和分子筛纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明:重组植酸酶PhyC1最适pH为6.5,在pH5.0-10.0的条件下具有较好的稳定性;重组植酸酶PhyC1最适温度为50℃。与现有商品植酸酶相比,PhyC1具有两个显著的特性,如低温条件下具有高活性,尤其是在低于20℃时;在中性pH 7.0条件下仍具有90%以上的相对酶活性,因此,植酸酶PhyC1的优良特性为其在水产行业的应用奠定基础。     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

Asymmetric transesterification of secondary alcohols catalyzed by feruloyl esterase from Humicola insolens

A new asymmetric transesterification of secondary alcohols catalyzed by feruloyl esterase from Humicola insolens has been found. Although alcohols are not the natural substrates for this enzyme, a high R enantioselectivity was observed. Stereochemical studies showed that variations in substrate structure lead to strong variations in enantioselectivity. The highest enantioselectivities are obtained when the beta-carbon of the secondary alcohol is tertiary or quaternary.