霍乱毒素

霍乱毒素是一种很强的粘膜免疫佐剂,本介绍了霍乱毒素的结构、霍乱毒素毒性的分子机理及近年来在霍乱毒素佐剂活性方面的研究进展,并探讨了霍乱毒素佐剂活性的分子机理。     

烟草生产霍乱毒素B亚单位疫苗的免疫分析

用纯化的ＣＴＢ后腿肌肉注射免疫小鼠,每次１２．５μｇ,每隔１４天加强一次,共注射三次,末次免疫后两周收集血清,免疫小鼠诱导产生了特异性抗ＣＴＢ抗体。在ＣＨＯ细胞中,免疫小鼠血清能够中和ＣＴ的细胞病变效应;小鼠肠结扎实验表明,抗ＣＴＢ血清能够抑制ＣＴ结合细胞表面受体ＧＭ１神经节苷脂。这表明转基因烟草产ＣＴＢ在小鼠中能够产生抗细菌毒素的保护免疫力。     

霍乱毒素佐剂的研究进展

霍乱毒素（CT）是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,具有很强的免疫原性和佐剂活性,是当今研究得最多且最深入的粘膜免疫佐剂之一,CT本身有很强的毒副作用,而一定的毒性又似乎是发挥佐剂作用所必须的。通过各种改造,使之具备优良的佐剂活性而没有显的毒副作用是当前研究的主要目标。本从CT作为佐剂的作用机理出发,概述当前对其进行改造的几种研究方向。     

霍乱疫苗中残余霍乱毒素检测方法的建立及验证

采用间接酶联免疫法,即用神经节苷脂包被,加入待检样品,再加入兔抗霍乱毒素B亚单位抗体,用标准样品的吸光值(A值)对标准样品的浓度绘制4-参数拟合曲线,根据标准曲线计算出待测样品中的CT浓度。结果显示,在浓度范围(0.6～16)ng/ml之间,CT标准浓度和检测浓度成线性关系,r2=0.9986。精确度在浓度范围(0.6～16)ng/ml,CT的平均回收率在96.24%～114.44%之间。精密度:批内变异CV%≤12.98%,批间变异CV%≤18.48%。特异性CT浓度在10ng/ml时,平均回收率为102.6%;CT浓度在5ng/ml时,平均回收率为111.17%;CT浓度在2.5ng/ml时,平均回收率为123.83%。实验表明该方法可检测霍乱疫苗原液中CT的含量。     

2002~2004年兰州市流感疫苗免疫效果分析

2002~2004年每年9~11月在兰州市对我省使用流感疫苗进行血清学考核,3年用血凝抑制试验(H I)分别检测44、52、49人疫苗免疫前后不同4种血清型流感病毒的抗体水平。结果显示,接种疫苗者30~35 d后流感病毒4个血清型流感病毒H I抗体均有不同程度的增长,H1N1、H3N2、B(Yam agata)、B(V ictorian)保护率(≥1∶40)分别为91.72%、91.72%、81.63%和59.38%;免疫后人体H I抗体滴度的几何均数(GMT)分别为1∶221.76、1∶189.58、1∶71.04和1∶43.04;较接种前H I抗体滴度≥4倍的分别占53.79%(78/145)、58.62%(84/145)、75.51%(37/49)和58.37%(56/96)。血清学检测表明流感疫苗免疫效果好,免疫成功率高。     

用伤寒杆菌温敏突变株诱导小鼠免疫保护作用

<正>伤寒仍然是发展中国家的一个严重问题。在这些国家的供水和污水排放设施达到世界其它地区的水平之前,免疫仍是减少该病发病的最有效方法。时下可以使用的灭活全菌体疫苗仍很不理想,常伴有严重的副作用。在伤寒菌苗研究方面,目前正在致力研究的项目包括伤寒杆菌gal E和aro A减毒株,新的纯化荚膜多糖(Vi抗原)和外膜蛋白的方法。     

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品,在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达９９％;在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致,纯度达１００％;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ,与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中,ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致,可代替ＢＳ用于     

重组霍乱毒素B亚基与疟原虫多表位融合蛋白的免疫保护作用研究

对以霍乱毒素B亚基为载体蛋白的重组疟疾多价抗原在小鼠及恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用进行了研究。结果表明：该抗原免疫小鼠后,对约氏疟子孢子攻击的保护率在50%左右;恒河猴免疫后用1×10⁸食蟹疟裂殖子攻击,对照组2只动物在攻击后4d感染,感染持续30d以上;免疫组2只动物中,两只动物在感染6～7d后完全恢复,且1只推迟3d感染,说明该抗原具有免疫保护作用。     

霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）黏膜免疫佐剂的研究进展

霍乱毒素（CT）具有很强的黏膜免疫佐剂活性,是当今研究热点之一,但CT的黏膜免疫佐剂效应机理尚未完全弄清。本文主要就霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）的黏膜免疫佐剂作用进行综述。     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素Ｂ亚基基因上游ＸｂａＩ～ＣｌａＩ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素Ｂ亚基表达水平可达２００ｍｇ／Ｌ,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在０．３～１０ｍｇ／Ｌ之间,大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的表达量达４１００单位／ｍｌ。在该启动子的控制下霍乱毒素Ｂ亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是霍乱毒素操纵子中霍乱毒素Ｂ亚基表达量是Ａ亚基的６倍的原因。     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素B亚基基因上游Xba Ⅰ～Cla Ⅰ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素B亚基表达水平可达200mg/L,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在0.3～10mg/L之间,大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的表达量达4100U/ml。在该启动子的控制下霍乱毒素B亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是由于霍乱毒素操纵子中霍乱毒素B亚基表达量是A亚基的6倍。     

宋内Ⅰ相O抗原及霍乱毒素B亚基在福氏2a痢疾菌中的表达及其免疫保护效果的观察

本文利用基因重组的方法,将宋内Ｉ相Ｏ抗原基因以及霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ｃｔｘ－Ｂ）克隆至带链球菌的ａｓｄ基因的表达载体,然后转化至ａｓｄ－痢疾菌苗株福氏２ａＴ３２。脂多糖银染以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实以上两基因都能在宿主菌中稳定表达。动物（小白鼠）保护实验表明,该重组菌对福氏２ａ、宋内氏痢疾菌的保护效率达１００％,对霍乱弧菌的保护效率也达７０％。该菌具有稳定、无抗生素标记、多价的特点。     

rBS-WC霍乱疫苗的动物免疫方案及免疫持久性

用小鼠、家兔观察了rBS-WS疫苗免疫的部分方案的效果。rBS与WC单独使用的免疫效果不如组合使用的效果好;小鼠或家兔的免疫间隔作适当缩短对免疫保护影响不大;小鼠一次大剂量口服疫苗后亦可获得良好保护。家兔肌肉注射免疫条件下rBS-WC与吸附霍乱类毒素菌苗(上海苗)及吸附霍乱菌苗(武汉苗)进行比较,武汉苗无抗CT反应,对CT攻击无保护,对Eltor(小川)攻击保护效果较差,上海苗则抗CT反应较低。家兔口服rBS-WC半年后,抗CT及杀弧菌抗体维持较高水平,显示其动物免疫的持久性。     

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ｃｔｘ Ｂ基因上游Ａ基因部分序列对ｃｔｘＢ表达水平的影响,结果表明：（１）将霍乱毒素操纵子ＸｂａＩ－ＥｃｏＲｉ片段克隆至ｐＵＣ１９,构建的质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ中Ａ亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠菌后的ＣＴＢ的表达产量为３０μｇ／μｌ;（２）在质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ的ＸｂａＩ位点引入移码突变,构建质粒ｐＭＣ０２Ｃ,使Ａ亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码,Ｂ     

转基因烟草表达霍乱毒素B亚单位的研究

将霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴＢ）基因克隆到质粒ｐＢｉｎ４３８中,分别构建植物表达载体ｐＢＩ－ＣＴＢ、ｐＢＩ－ＳＰＣＴＢ和ｐＢＩ－ＣＴＢＥＲ。采用叶盘法分别转化烟草Ｋ３２６,各表达载体得到了一批较基因植株。转基因烟草的ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ＣＴＢ基因整合到了烟草基因组中。转基因植株的ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ｐＢＩ－ＳＰＣＴＢ和ｐＢＩ－ＣＴＢＥＲ的转基因植株能有效表