蜕皮激素与丝蛋白合成:植源性蜕皮激素对家蚕后部丝腺核酸代谢的影响

给家蚕五龄幼虫添食植源性蜕皮激素(以下简称MH),对后部丝腺的核酸代谢都有直接影响,但由此引起的效应却是复杂的,与添食的时期和剂量以及蚕品种等因素有关。五龄每天低剂量(夏蚕0.5微克/头,春蚕2微克/头)连续添食和前期一次添食(2—4微克/头)对后丝腺RNA的合成都有明显的促进作用,并且RNA含量增长高峰是在五龄中期以后;每天较高剂量连续添食和中期一次添食,都表现为抑制作用。添食MH对后部丝腺DNA合成的影响与RNA的变化不尽一致;在每天0.5微克/头连续添食区表现出强烈的促进作用,而其余各处理区都出现明显的抑制。由此认为MH能直接作用于遗传物质DNA,通过调节有关基因的复制或者转录速度,从而对丝蛋白的生物合成产生某种影响。     

RNA干扰对家蚕丝腺蜕皮激素相关基因表达的影响

昆虫变态发育过程中,蜕皮激素通过一系列的激素相关转录因子进行信号的转导和放大,从而完成对生长变态发育的调控,其中蜕皮激素受体(EcR)及转录因子BR-C和E74A可能作为早期因子发挥作用.为了研究这3个早期转录因子在鳞翅目昆虫中的功能,本研究采用体外合成dsRNA的方法,将合成的dsRNA分别注射熟蚕期的家蚕Bomby...     

保幼激素类似物对家蚕丝腺与脂肪体蛋白质合成的调节作用

应用示踪原子法,研究了家蚕Bombyx mori 5龄幼虫丝腺与脂肪体细胞内蛋白质合成的变化规律及保幼激素类似物(JHA738)的调节作用。从5龄初到龄末,家蚕丝腺细胞内蛋白质合成持续升高,5龄中期、后期的蛋白质合成活性分别是前期的1.60倍和2.86倍;全龄出现2个合成高峰,一个是在5龄72h,为细胞固有蛋白质合成高峰,另一个是在5龄192h,为丝蛋白合成高峰。脂肪体细胞内蛋白质合成作用呈现脉冲式的变化。在5龄前期和中期用JHA处理家蚕(剂量为4μg/条),对丝腺细胞固有蛋白质合成和脂肪体细胞蛋白质合成均表现出抑制作用,而对丝蛋白合成则表现出促进作用。本实验结果为进一步阐明JHA增丝机理提供了直接证据。     

丝蛋白合成和分泌期家蚕丝腺中有氧氧化特性分析

【目的】有氧氧化中葡萄糖(Glc)、丙酮酸(PA)、乙酰Co A(AC)、还原型吡啶核苷酸(NADH)和腺苷三磷酸(ATP)摩尔数的理论比值为1∶2∶2∶10∶30~32,而己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶1(PFK1)、丙酮酸激酶(PK)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、柠檬酸合酶(CS)、异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)、NADH泛醌还原酶(NCR)、琥珀酸泛醌还原酶(SCR)、泛醌细胞色素C还原酶(CCR)、细胞色素C氧化酶(CCO)和ATP合酶(AS)活性的理论比值为1∶1∶2∶2∶2∶2∶2∶10∶2∶12∶12∶26~28。本研究旨在分析丝蛋白合成和分泌期家蚕Bombyx mori丝腺有氧氧化的特性。【方法】利用分光光度法和高效液相色谱法测定了上述生化指标的变化。【结果】丝蛋白合成和分泌期家蚕丝腺中检测不到Glc,产物含量以1/30 ATP,1/10 NADH,1/2 AC和1/2 PA的顺序递增;糖酵解途径相关酶活性,以PFK1活性最低;三羧酸循环相关酶活性以1/2 ICDHm,1/2α-KGDH和1/2 CS的顺序递增;氧化磷酸化相关酶包括1/26 AS,1/10 NCR,1/2 SCR,1/12 CCR和1/12 CCO的活性以1/26 AS活性最低;1/26 AS,1/2 ICDHm,1/2 PDH和PFK1的活性依次递增。NADH含量、ATP含量、PFK1活性、PDH活性和NCR活性在丝蛋白合成期升高,但在丝蛋白分泌期下降。【结论】据此推测,家蚕丝腺中PFK1,ICDHm和AS分别是糖酵解途径、三羧酸循环和氧化磷酸化的限速酶;糖酵解途径、丙酮酸脱氢、三羧酸循环和氧化磷酸化速率依次递减;有氧氧化速率在丝蛋白合成期升高,相反在丝蛋白分泌期降低。     

蜕皮激素对家蚕后部丝腺谷氨酸-丙酮酸转氨酶活力的影响

本文报道了β-蜕皮激素(简称MH)对家蚕后丝腺谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称GPT)活力以及产丝量的影响。对五龄不同时期一次添食MH和每日连续添食MH以及MH剂量变化的研究结果表明:无论何种处理,MH都能促进GPT的活力;但不同的处理,其效果不一样。其中以五龄前期添食MH和五龄每日低剂量(夏蚕每头0.5微克和春蚕每头2微克)连续添食的处理,效果最佳;不但能促进GPT的活力,而且能提高丝蛋白合成能力。此外,还发现添食MH的浓度与GPT活力并不相关;MH对GPT活力的影响,因蚕品种而有差异,春蚕多丝量品种较夏蚕少丝量品种效果显著;MH低剂量多次添食比高剂量一次添食可避免产生不良后果。     

蜕皮激素对家蚕脂肪体中BmATG8蛋白亚细胞定位与细胞核皱缩的调控

【目的】昆虫脂肪体是物质合成代谢、先天免疫的重要器官。ATG8蛋白的亚细胞定位是细胞自噬的主要指标之一,细胞核皱缩是细胞凋亡的形态标记之一,目前家蚕 Bombyx mori 中尚未在蜕皮和变态发育进程中对BmATG8蛋白的细胞生物学变化进行观察。本研究旨在同时检测家蚕脂肪体细胞中BmATG8蛋白亚细胞定位和细胞核皱缩的时空变化,研究蜕皮激素(20E)信号对两者的调控作用。【方法】利用免疫荧光和Hoechst染色方法,分别在家蚕幼虫4龄第2天至预蛹第2天、5龄第2天幼虫注射20E (10 μg/头)后以及对游走期幼虫脂肪体中20E受体基因 usp 进行RNAi后,检测家蚕脂肪体中BmATG8蛋白定位和细胞核形态变化。【结果】在家蚕幼虫蜕皮和幼虫-蛹变态发育时期,BmATG8蛋白高水平存在于脂肪体细胞中,同时细胞核发生皱缩。在正常摄食时期,20E处理(10 μg/头)能够诱导细胞中大量出现BmATG8蛋白且存在于细胞质中并诱导细胞核皱缩。对 usp 基因进行RNAi后,脂肪体细胞内的BmATG8蛋白显著减少,同时细胞核皱缩减弱。【结论】家蚕BmATG8蛋白不仅在幼虫-蛹变态时期细胞质中大量存在,而且在幼虫蜕皮时期也大量表达,与细胞核的皱缩同时出现,BmATG8蛋白在细胞质中的定位与细胞核皱缩两者均受到 20E信号通路的调控。本研究为BmATG8蛋白功能及其调控机制的深入研究提供了重要的科学依据。     

家蚕丝心蛋白H链基因的荧光原位杂交(FISH)

蚕丝业在国民经济中占有极为重要的地位. 家蚕作为重要的模式生物和生物反应器, 历来为人们所关注. 有关蚕丝基因的结构、表达调控和分子进化都已有较详细的研究和报道, 但关于蚕丝结构基因的分子细胞遗传学基因定位的研究, 几乎尚无报道. 经用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)对家蚕丝心蛋白H链基因(Fib-H)的分子细胞遗传学定位研究结果, 初步将家蚕丝心蛋白H链基因定位在了分子细胞遗传学第25连锁群染色体的端部, 即25~0.0的位置, 从而解决了该基因迄今尚未定位的问题, 并证实了丝心蛋白H链基因在染色体位置上为单一座位.     

家蚕前部丝腺特异表皮蛋白Bm11721的鉴定及表达

家蚕的丝腺是其丝蛋白合成和分泌的器官,根据其形态和功能的不同分为前部、中部和后部丝腺,前部丝腺不具有合成丝蛋白的能力,是丝蛋白构象发生转变的场所。剪切力在丝蛋白构象转变中起到重要的作用,其在家蚕前部丝腺主要由前部丝腺逐渐变细的管腔结构和富含几丁质及表皮蛋白的坚硬的内壁提供。鉴定家蚕前部丝腺新的几丁质结合蛋白,并调查其在家蚕幼虫不同组织的表达特征。通过几丁质亲和层析的方法在前部丝腺筛选并鉴定到一个新的具有几丁质结合功能的表皮蛋白Bm11721,其编码基因编号为BGIBMGA011721(Gen Bank Accession No.NM-001173285.1)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白,通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了Bm11721的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平Bm11721均只在前部丝腺特异表达,且Bm11721蛋白在5龄期的前部丝腺中恒定表达。免疫荧光定位结果显示Bm11721蛋白定位在前部丝腺的内膜中,推测其可能与前部丝腺的机械硬度有关,为丝蛋白的构象转变提供剪切力。     

斜纹夜蛾蜕皮激素受体与超气门蛋白的原核表达及活性检测

双酰基肼类杀虫剂模拟天然蜕皮激素作用影响幼虫蜕皮。昆虫蜕皮激素受体的高度敏感性和专一性要求必须建立新的杀虫活性检测技术, 以适应快速准确和大批量筛选的要求。本研究采用RT-PCR技术, 获取斜纹夜蛾Spodoptera litura蜕皮激素受体（EcR）与超气门蛋白（USP）功能域目的基因, 构建EcR、 USP功能区基因原核表达载体（pEHISEGFPTEV-EcR_cde和pEHISEGFPTEV-USP_cde）。载体经诱导表达和蛋白纯化, 获得EcR和USP功能区纯化蛋白。在蛋白浓度l mg/mL, ³H-PonA终浓度8 nmol/L的条件下, 采用放射性配基受体结合分析测定了4种药剂（虫酰肼、 呋喃虫酰肼、 抑食肼和灭幼脲）不同浓度下的放射性比活的变化。结果显示： 随着药剂浓度的逐渐增大, 前3种药剂的放射性比活都有不同程度的降低, 其中虫酰肼的放射性比活降低程度最大, 其次是呋喃虫酰肼和抑食肼, 灭幼脲的放射性比活基本无变化。这些结果表明相同条件下虫酰肼比呋喃虫酰肼和抑食肼有更高的杀虫活力, 本研究的方法可对双酰基肼类杀虫剂或者先导化合物进行初步筛选。     

盐离子对次壶腹腺丝蛋白重组模块的影响

为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响,首次以MiSp序列为对象,研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类(浓度)盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲(Random coil)或α螺旋(Helix),在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠(β-sheet),甲醇能促进该转变过程。另外,钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础,同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。     

桑蚕促前胸腺激素的作用与前胸腺分泌活动的某些特点

本工作以前胸腺的体外器官培养技术和蜕皮激素的放射免疫分析法(MH-RIA)相结合,研究了桑蚕(Bombyx mori)促前胸腺激素(PTTH)的作用与前胸腺分泌的某些特点。结果表明,被PTTH激活后的前胸腺,在一定的时相过程内合成并分泌脱皮甾类激素;前胸腺本体不积累蜕皮甾类激素;PTTH对前胸腺的作用是积累性的;五龄不同天数的前胸腺合成分泌脱皮甾类激素的能力不同,并有不同的剂量反应。     

大肠杆菌及聚肌胞核苷酸对柞蚕、家蚕蛹诱导产生溶菌酶、抗菌肽及凝集素的动力学

大肠杆菌D₃₁诱导柞蚕蛹产生抗菌多肽。同时,溶菌酶和凝集素活性都比诱导前有明显增高.其活力高峰、抗菌多肽在第7天左右、溶菌酶在第5天,而凝集素在第3天即达最高水平。不同品种的柞蚕蛹,经诱导产生的三种活性物质其活力差异不明显,但741、河四和小混品种中的抗菌多肽P_9A及P_9B组成比例较高。上述三种活性物质的诱导变化与性别有关,雄性高于雌性。比较了柞蚕蛹和家蚕经细菌诱导后上述三种活性物质的变化,家蚕凝集素活力很低,诱导后活力增高不明显。抗菌活力及溶菌酶活力的提高程度柞蚕也高于家蚕。聚肌胞核苷酸(Poly I:C)也能诱导两种蚕产生抗菌多肽及溶菌酶,但活力提高的显著程度都不及大肠杆菌诱导,凝集素活力变化也不显著。     

氚标记睾丸酮在家蚕体内的吸收和分布

在家蚕Bombyx mori L.的五龄起蚕期,添食氚标记的雄性激素丙酸睾丸酮(代号³H-TP),用液体闪烁谱仪探查五龄期蚕体对³H-TP的吸收与排泄、贮存与分布及雌雄间的差异.结果证明:蚕体对³H-TP的排出率在添食后24小时达峰值,累计吸收率雄性为85.81%、雌性为68%,雌雄间有明显差异.蚕体内务组织器官对³H-TP的吸收也有显著不同,中肠、血液在添食后2小时,脂肪体在72小时、体壁在48小时,其放射活性为最大值,雌雄间均无明显差异;生殖腺则在添食后168小时达峰值,且雄性显著高于雌性;丝腺中相对含量比较稳定,雌雄之间无较大差异.³H-TP在蚕体各组织器官中的贮存与分布表现为:五龄初期(添食后2小时)以中肠和血液最多,共达85%左右;五龄中期(添食后96小时)以性器官最高(28%左右);五龄末期(添食后192小时)性器官中高达34.58%,且雄性(40.4%)显著高于雌性(28.74%).上述研究结果说明,在家蚕五龄起蚕期添食³H-TP,能被蚕儿多量吸收和贮存在体内,其中尤以生殖器官的相对含量最多,雌雄间亦有明显差异.由此表明,雄性激素可能对家蚕具有某种生理活性.     

家蚕中的5-氧脯氨酸酶及保幼激素类似物对它的影响

本工作首次在家蚕Bombyx mori的马氏管、中肠、丝腺及脂肪体等组织中测到了γ-谷氨酰循环中一个关键酶——5-L-氧脯氨酸酶的活力.该酶以马氏管中活力最高,在蚕的中肠、血淋巴中均存在有游离的5-氧脯氨酸.观察了保幼激素类似物(JHA)处理后,家蚕中肠、丝腺和脂肪体中5-L-氧脯氨酸酶活力的变化,同时观察了血淋巴中5-氧脯氨酸含量的变化.对该酶及γ-谷氨酰循环在蚕体中氨基酸转运上的可能作用进行了讨论.     

大劣按蚊雄蚊的交配能力和日龄及交配次数对其生殖系统形态学影响的观察

本文在实验室条件下,观察大劣按蚊(Anopheles dirus)雄蚊交配能力和日龄、交配及交配后间歇期对其生殖系统形态学的影响.羽化后1小时可见丝状精子,22小时尾器全部旋转180°.3—12日龄雄蚊交配能力最强.随着日龄增加,精囊数逐渐减少,睾丸内成熟精子占据整个睾丸的比例逐渐增加,附腺透明区宽度变窄直至消失.多次交配比一次交配后,其睾丸内精子量减少、透明区宽度增加明显;交配后经过一定间歇期后,生殖系统能重新恢复活力,但多次交配后其恢复程度和速度远比交配一次者为慢.大劣按蚊雄蚊生殖系统的变化可初步判断其日龄和交配史.     

七星瓢虫的卵黄发生:植入雄虫的卵巢中卵黄原蛋白的合成

为了证实七星瓢虫的卵巢能合成卵黄原蛋白, 并查明雄虫体内是否具有卵黄发生所必需的激素环境, 我们将刚羽化雌虫的一侧卵巢或数个卵巢管植入雄虫体内.移植的卵巢或卵巢管在雄虫体内能够发育, 其卵母细胞能沉积卵黄, 一部分可达成熟.体外培养证明移植的卵巢可合成卵黄原蛋白, 但受体雄虫的脂肪体不合成卵黄原蛋白, 而且其血淋巴中也不存在这种蛋白.用保幼激素类似物ZR-512处理受体雄虫, 可促进移植卵巢的发育, 但不能诱导其脂肪体合成卵黄原蛋白.此结果表明, 象大多数昆虫一样, 七星瓢虫的卵黄发生的性二型现象表现在激素的靶组织——脂肪体, 而不是激素本身.     

柞蚕蛹血淋巴中凝集素的分离鉴定

在柞蚕蛹血淋巴中可以测得血凝活力,但在大肠杆菌诱导后血淋巴中血凝滴度有很大的升高.本文报道了分离正常柞蚕蛹血淋巴中凝集素的提取步骤.所得的凝集素在SDS垂直板电泳中表现单一条带,免疫扩散呈现单一的沉淀带,分子量为40,000道尔顿.制剂能凝集兔、鸭、豚鼠、羊、马及人的A、B、O和AB型的红细胞.其凝集活力可被半乳糖,乳糖,及N-乙酰半乳糖胺所抑制. 诱导后的柞蚕蛹血淋巴的凝集素成分比较复杂,经亲和层析后的制剂在免疫琼脂双扩散盘中呈现二条沉淀带,在垂直电泳中至少有二条带.