一个与小鼠锌指蛋白基因ZF—12相关的假基因的克隆和鉴定

小鼠类Krueppel锌指蛋白基因ZF-12为人的类Krueppel锌指蛋白基因ZNF191的同源基因,它们都编码368个氨基酸残基,N端存在SCAN结构域,C端有4个连续的锌指模体,最近的研究表明ZNF191是肝癌发生的相关基因,我们以人锌指蛋白基因ZNF191的vDNA为探针,筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,意外地获得了1个与小鼠锌指蛋白基因ZF-12相类似的基因,多种组织的RT-PCR和启动子序列分析,暗示该基因不表达,且该基因无内含子,与ZF-12高度相似,存在突变,暗示其为与ZF-12相关的假基因序列,经查新证实它为新的序列后,以ZF12p（ZF-12pseudogene)命名在GenBank登录（AY040222）。查录GenBank的人类基因组库以及Southern结果显示人类基因组中无ZNF191假基因序列,ZF12p与ZF-12高度相似,暗示ZF12p在进化过程中产生的时间较晚,这对研究锌指蛋白基因ZF-12的突变与进化具有重要的意义。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与基因结构以及5′端启动子活性的分析

人类锌指蛋白ZNF191为类krueppel转录因子,其可能与神经精神病、心血管疾病和肝癌等疾病的发生或发展有关,为了采用基因敲除模型来探讨它的生理功能,克隆和定位其在模式生物（小鼠）中的同源基因,并阐明其结构特征是必需的。通过筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,获得了它在小鼠中的同源基因ZF－12基因组全长片段。序列分析表明：该基因含有4个外显子和3个内含子,内含子都遵循GT／AG的剪接模式;第91密码子处存在单核苷酸多态性;可能存在2种大小不同的3′端的非翻译区（3′－UTR）;与锌指蛋白基因Zfp-35相连锁,可将其定位于18号染色体的B3－C带上或附近;5′端上游存在1个约250bp高度富含GC的启动子序列。ZF－12基因的5′端系列缺失荧光素酶基因报告载体的瞬时转染实验表明:其上游序列（-762～ 70bp）具有启动子转录活性,在更上游的序列（－824～-762bp)上可能存在负调控元件。这项研究结果为进一步的基因敲除研究奠定了基础。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

锌指蛋白基因ZNF191

锌指是Ｍｉｌｌｅｒ等人 (1 985年 )最初在爪蟾转录因子ＴＦ ＩＩＩＡ中发现的一种特殊结构 ,即在蛋白质一级结构上 ,存在着Ｃ Ｘ2 4 Ｃ Ｘ12 Ｈ Ｘ3 Ｈ的序列单元 (Ｃ :半胱氨酸 ;Ｈ :组氨酸 ;Ｘ :任意氨基酸 ) ,其中的 2个半胱氨酸和 2个组氨酸通过配位键与一个锌离子结合 ,成手指状结构 ,这类序列单元被称为锌指模体 ,含有锌指模体的蛋白质称为锌指蛋白。研究表明 ,锌指蛋白作为一类转录因子而广泛地参与基因表达的调控。这种调控作用主要是通过它与特定的ＤＮＡ序列 (如启动子 )和蛋白质的结合而实现的。锌指蛋白与胚胎发育和细胞分化…     

一个有假基因特点的鼻咽癌相关基因的分离和克隆

用定位候选克隆法克隆了一个与鼻咽癌相关的基因,命名为NAG73基因,结构分析显示NAG73的基因序列无内含子,无典型的启动子序列,polyA尾,与人类生长激素促分泌因子基因的第4个外显子和3′端非翻译区同源,说明NAG73可能是人类生长激素促分泌因子基因的假基因,同时,实验证明NAG73在一些细胞和组织中活跃表达,在正常鼻咽上皮细胞,鼻咽癌上皮细胞和鼻咽癌活检组织,NAG73有表达差异,序列分析显示NAG73有编码翻译产物的可能,NAG73可能可编码产物,该产物在鼻咽癌的发病发展中发挥作用。     

锌指基因ZNF268两个新的差异剪接本克隆及鉴定

ZNF268是一个典型的KRAB类锌指基因,含有24个C2H2型锌指基序和一个KRAB功能域,它在人胚胎发育早期表达,并与胚胎肝脏的发育相关。本研究通过免疫组化的方法,发现ZNF268在3～5周龄人胚的造血干细胞中有表达;进一步通过RT-PCR的方法检测发现ZNF268在健康成人全血细胞中也有表达,并且表达有4个差异剪接本,从中克隆得到两个新的ZNF268差异剪接本ZNF268c和ZNF268d。推测ZNF268和血细胞生长发育相关。     

一种新型锌指蛋白基因——人ZNF313的克隆、定位及表达

运用正常可育男性和无精症病人睾丸组织的mRNA差异显示和cDNA末端快速扩增（PACE）等方法,从人睾丸组织中分离了一个同时含有指环结构和C2H2结构域的新型锌指蛋白基因——人ZNF313。运用荧光原位杂交（FISH）方法,将该基因定位到人染色体20q13。该基因含6个外显子,编码228个氨基酸。基因组结构分析显示,外显子6含有的2个加尾信号,产生2种不同的3‘端非翻译区。Northern杂交及多组织RT-PCR的结果显示该基因含有0.75kb和2.4kb两种转录本,其中0.75kb转录本在正常睾丸中高表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中该基因代表达。结果提示：人ZNF313基因对精子发生和男性可育性可能起重要作用。     

在人类胚胎发育过程中表达的新锌指蛋白基因ZNF359的研究

kriipple型锌指蛋白是一类具有重要功能的转录调节因子。初步克隆了一个新的人类kriipple型锌指蛋白基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF359。此基因长3271个碱基,含6个外显子,在基因组DNA上长18kb。它编码的蛋白质全长643个氨基酸,含一个KRAB框,16个C2H2型的锌指,在两者之间还有一个典型的中间重复序列。Northern Bolt分析表明该基因在人类早期胚胎的各个组织中普遍表达,且在肾、心脏和肺的表达水平最强。其结构和表达特征预示着它编码的是一个具DNA结合功能的转录调控因子。     

一个新的人类锌指蛋白基因ZNF474的cDNA克隆和表达分析

数据库消减杂交就是利用NCBI中的Unigene数据库中大量的数据资源,收集各种细胞或组织的基因表达谱进行两两比较或多重比较,获得两组文库间有统计学意义的差异表达基因。运用NCBI中的数据库消减杂交分析方法,从人睾丸组织中分离了一个含有C2H2结构的新型锌指蛋白基因-ZNF474(GenBank登录号：AY461732)．通过推导和进一步的RT—PCR实验证实：该基因含2个外显子,gDNA在染色体上跨度30065bp,定位于人染色体5q23．1-q23。2．cDNA编码一个含364个氨基酸的新蛋白,分子质量是40．3kDa,等电点为9．59。Northem杂交结果显示：该基因含有2．37kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中很强表达,卵巢中有弱表达,而其他组织中该基因无表达．结果提示：ZNF474基因对精子发生和卵母细胞的发育可能起重要作用、     

一种新的人端粒相关锌指蛋白cDNA的克隆及鉴定

为了从早期胚胎寻找与发育分化有关的新基因,本文构建了3周龄人胚cDNA文库,并应用EST技术对该文库中随机挑选的47个低丰度克隆进行测序,结果发现了一个与人亚端粒DNA和锌指基因同源的cDNA克隆(L30),该基因长约3.8kb,5＇端序列有明显的阅读框架(ORF),3＇端序列有加尾信号(AAUAGA)和有39个A组成的Poly(A)尾巴;通过Northern杂交确认在早期人胚胎中有表达,应用地高辛染色体原位杂交技术将其定位于人第12号染色体长臂端部.     

用人/啮齿类体细胞杂种系及荧光原位杂交将人类新基因ZNF191定位于染色体18q12.1

本文以锌指蛋白ZNF191全长cDNA为探针,与人/啮齿类体细胞杂种系DNA杂交,将这个新的人类锌指基因定位于18号染色体。又用该cDNA筛选人基因组DNA lambda/DASH文库,以获得的DNA片段为探针,进行人染色体荧光原位杂交(FISH)分析,将ZNF191基因精细定位在染色体18q 12.1区带。依据有关遗传连锁分析和等位基因荧光原位杂交(FISH),将ZNF191精确定位于人染色体18q12.1。通过遗传连锁及染色体杂合性丢失分析.目前已知多种遗传病和肿瘤与这个区域相关。因此,ZNF191基因可作为这些疾病或肿瘤的候选相关基因。     

利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C_2H_2型锌指蛋白基因表达序列

本文利用锌指基序的保守性设计引物,在低严谨条件下扩增人基因组总DNA,获得8个长度呈梯度的PCR扩增产物电泳条带。取其中第2和第3电泳条带,回收DNA片段并将它们克隆,经测序和查新比较,共获得60个含有锌指蛋白基因基序的单一的序列,其中23个为新的锌指蛋白基因DNA片段。以它们为探针,杂交筛选人脑组织cDNA文库,得到初筛cD-NA克隆44个。对其中28个初筛cDNA克隆进行复筛之后,得到20个cDNA单克隆。对这些阳性克隆进行测序,读出18个含有锌指蛋白基因基序的序列,国际联网查新之后,证明其中16个是新的锌指蛋白基因片段。这些新的锌指蛋白基因片段为今后克隆有意义的全长锌指蛋白cDNA提供了重要的实验材料。     

杀菌通透性增加蛋白基因的克隆及在CHO细胞中的表达

从一名健康中国人外周血白细胞中克隆出杀菌 通透性增加蛋白 (BPI)基因 ,全长1 45 2bp,编码 2 7个氨基酸的信号肽和 45 6个氨基酸成熟蛋白。序列比较发现 ,此序列与国外发表的序列有 6个核苷酸的差异 ,编码蛋白有 4个氨基酸的差异。构建真核表达质粒 ,在CHO细胞中实现BPI基因的稳定表达。对重组蛋白初步纯化后进行杀菌实验 ,结果表明重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物活性。     

三角帆蚌热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

对三角帆蚌HSP70基因序列进行全长克隆及其分子生物学分析,并检测其在不同水温刺激下鳃组织中的表达变化。通过高通量转录组测序获得三角帆蚌HSP70基因（HcHSP70）长片段,采用3'RACE对其进行了3'末端克隆,经拼接得到HcHSP70 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对HcHSP70 cDNA全长序列进行了特征分析,采用实时荧光定量PCR技术检测了其组织分布,并结合Western-blot技术检测蚌鳃中该基因mRNA与蛋白经不同水温刺激后的表达变化。结果显示,HcHSP70 cDNA全长为2298 bp,其中开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸。预测分子量大小为71.6 Ku,pH7.0时的理论等电点为5.61。氨基酸序列分析表明,HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3个标签序列（I₉DLGTTYS₁₆、I₁₉₇FDLGGGTFDVSIL₂₁₀和I₃₃₆ VLVGGSTRIPKVQK₃₅₀）,与长牡蛎及泥蚶的HSP70同源性最高（91%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HcHSP70在鳃、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5种被检组织中均有表达,以肝胰腺中的表达水平最高。实时荧光定量PCR与Western-blot技术检测皆表明,蚌鳃组织中HcHSP70基因与蛋白的表达量在37℃时达到最高,而在40℃水温刺激下表达水平下调至正常值,表明其在适应高温刺激时发挥了重要作用。     

大豆类受体蛋白激酶基因GmRLCK的克隆及初步分析

植物类受体蛋白激酶(receptor-likeproteinkinase,RLK)在高等植物生长发育和环境刺激的信号传导中起着重要的作用。本文报告了一个新的大豆类受体蛋白激酶基因的全长cDNA克隆及对其基因结构和功能的初步分析。研究表明该基因序列编码的蛋白包含一个跨膜域、一个具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞内域和一个缺少N-末端信号肽的胞外域。采用生物信息学方法分析表明,该基因与一些拟南芥菜类受体蛋白激酶基因具有很高的相似性,这些激酶N-末端都缺少信号序列,属于植物胞质类受体激酶(receptor-likecytoplasmickinase,RLCK)亚家族。因此命名该大豆基因为GmRLCK(GenBankAccessionNo.AY687390)。对GmRLCK激酶域中磷酸化可能性较高的位点进行了预测。RT-PCR的结果表明,GmRLCK在大豆子叶、根、花以及豆荚中都有较高的表达,而在胚根、茎和成熟叶片中的表达相对较弱。进化分析表明GmRLCK与一些衰老相关的植物类受体蛋白激酶具有较近的亲缘关系。     

八肋游仆虫酸性核糖体蛋白基因克隆与特征分析

原核和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类酸性核糖体蛋白,在大肠杆菌中,分别为L10和L7/L12蛋白,而在真核生物中是P0、P1和P2(简称P蛋白)。这些酸性核糖体蛋白共同组成五聚体复合物P0-(P1/P2)2,在大亚基上形成一个向外侧凸出的柄状结构(Ribosomalstalk)。酸性核糖体蛋白位于核糖体的活性部位,一方面     

雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达

叶绿体或者有色体中的质体球滴结构(Plastoglobules)是多数植物的类胡萝卜素等次生代谢产物积累的场所,但在能大量积累虾青素的雨生红球藻中,这个结构一直没有得到确认。通过透射电子显微镜观察发现雨生红球藻的质体内确切存在plastoglobules结构;并通过RT-PCR结合RACE技术,从雨生红球藻cDNA文库中克隆到了与编码plastoglobules的结构蛋白(Plastoglobulin)具有高度同源性的基因序列全长,称做Hpgp基因;该基因的表达产物称之为雨生红球藻质体球滴蛋白(HPGP;Haematococcus plastoglobules pro-tein);并进一步利用原核表达系统将该编码基因进行原核诱导表达,用His-Tag蛋白分离纯化系统纯化到了目标蛋白,并用该His-Tag融合蛋白为抗原免疫实验兔,制备到了相应的一抗抗体,为下一步对该蛋白的功能阐明以及雨生红球藻的虾青素积累机制研究提供重要的基础。     

非洲爪蟾短型肽聚糖识别蛋白基因的克隆与鉴定

采用生物信息学方法首次对非洲爪蟾短型肽聚糖识别蛋白(xePGRP-S)基因进行了克隆,并对其在胚胎发育和成年爪蟾各组织中的表达状况进行了分析。xePGRP-ScDNA全长720bp,开放阅读框为549bp,编码182个氨基酸。序列比对显示xePGRP-S与其他物种PGRP-S的序列相似性在42.4%-50.5%之间。RT-PCR显示在非洲爪蟾胚胎发育至3d时可以明显检测到xePGRP-S的表达,之后呈持续性表达,且在所检测的心、肝、脾、肺、肾、肠和胃这7种组织器官中呈组成型表达。