线粒体DNA甲基化研究进展

DNA甲基化是表观遗传修饰的重要方式之一.线粒体是真核细胞内的关键细胞器,线粒体DNA(mt DNA)编码部分线粒体基因,其mt DNA的甲基化修饰可能引起所编码基因的异常表达,从而参与调节生理和病理过程.本文就目前mt DNA甲基化及其在疾病中的研究进展进行总结.     

Validation of the diagnostic potential of mtDNA copy number derived from whole genome sequencing

正Diagnosis of mitochondrial DNA(mt DNA)disorders has traditionally been focused on the presence of point mutations and large deletions.However,deviations in mitochondrial abundance or mt DNA copy number can also be associated with many physiological and pathological conditions(Bai and Wong,2005).For example,reduced mt DNA copy number could be a result of defective mt DNA biosynthesis or mt DNA replication and is associated     

几种鱼肝线粒体基因组的研究

我们用简易方法提纯了武昌鱼、乌鱼、草鱼和白鲢肝脏线粒体(mt)DNA。武昌鱼mt DNA经五种限制酶BamHI、BglⅡ、BglI、EcoRI和HindⅢ单酶完全酶解分别产生2、2、3、3和3个片段。乌鱼肝mt DNA用EcoRI、BamHI、pstI和BglⅡ单酶解分别得到1、2、2和2个片段。草鱼mt DNA亦作相应的酶解。所有各片段经琼脂糖凝胶电泳测定出它们的分子量(MW):武昌鱼肝mt DNA的MW10.2×10~6道尔顿,长约16.6kb;乌鱼肝mt DNA MW9.99×10~6道尔顿,长16.2kb;草鱼mt DNA的分子量10.13×10~6,长16.22×10kb。用七对限制酶双酶全酶解构建出武昌鱼mt DNA五种限制酶图谱。用六对限制酶双酶解构建出乌鱼mt DNA四种限制酶图。以酵母线粒体15S rRNA为探针对武昌鱼、白鲢鱼和乌鱼mt DNA12S rRNA基因进行了初步定位。     

人类线粒体tRNA生物合成与线粒体疾病

线粒体是普遍存在于真核细胞中的一类细胞器.每个线粒体含有多个拷贝的闭合环状双链DNA. 人类线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)共编码22种线粒体tRNA(mitochondrial tRNA,mt tRNA), 2种rRNA 及13种多肽.mt tRNA独特的结构特点决定了它们与具有典型三叶草结构的细胞质 tRNA不同.编码mt tRNA的基因突变频率较高,这可能是引起线粒体功能障碍的主要原因之一. 同时 ,这与很多病理现象相关.目前发现,大量与mt tRNA生物代谢和功能相关的核因子包括加工内切酶、 tRNA修饰酶和氨酰-tRNA合成酶.这些核因子的异常导致了疾病相关的tRNA致病突变.由此可见mt tRNA功能对于线粒体活性的重要性.     

适于基因组测序的高纯度的大豆线粒体基因组DNA提取方法

为满足高通量二代测序要求,本研究采用大豆黄花苗为试材,结合差速离心、蔗糖密度梯度离心及超速离心方法提取高纯度大豆线粒体基因组DNA(mt DNA)。结果表明,差速离心能够有效去除核基因组掺杂;超速离心与蔗糖密度梯度离心结合能够有效去除叶绿体污染。提取的mt DNA经琼脂糖凝胶电泳、紫外光度计检测及叶绿体和细胞核特异性引物检测表明,该方法提取的大豆mt DNA无叶绿体DNA及核DNA污染,且纯度高,可满足测序等对线粒体高纯度的要求,为研究大豆线粒体相关性状的机理奠定了坚实基础。     

Current approaches to reduce or eliminate mitochondrial DNA mutations

正Mitochondrial DNA(mt DNA)mutations have been implicated in a broad range of disorders which severely affect human health(Wallace,1999).Some drugs have been developed to slow down pathological changes of mitochondrial disorders.However,there is no effective treatment for patients with mt DNA mutations.mt DNA is less protected and has fewer repair mechanisms than nuclear DNA(n DNA).Such a reality results in a much higher mutation     

靶向核酸酶在线粒体基因组编辑中的应用

线粒体基因组(mt DNA)的突变可导致多种人类疾病,其中绝大多数的mt DNA突变是异质性的:即在细胞中同时存在突变型和野生型的mt DNA,当突变型mt DNA的比例达到一定阈值时,就会引发疾病的发生。线粒体靶向的核酸内切酶可以诱导mt DNA异质性的改变,将突变型mt DNA的含量控制在发病阈值之下,从而达到疾病治疗的目的。本研究介绍了线粒体靶向的锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)以及常规的限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)在线粒体基因组编辑及疾病治疗中的应用。     

Mitochondrial DNA as a Risk Factor for False Positives in Case-Control Association Studies

<正>During the last decade,hundreds of studies have been published examining whether significant associations exist between mitochondrial DNA(mt DNA)variants and/or haplogroups(clades)and particular diseases(generally common/complex diseases)(Fig.1).However,several authors have gathered evidence indicating a high incidence of false positive findings in mt DNA case-control association studies.     

哺乳类线粒体基因组

作为真核细胞的一种重要细胞器的线粒体含有独立的并自主复制和转录的DNA基因组。虽然线粒体蛋白质的大部分系核DNA编码,但有一小部分是线粒体DNA(mt DNA)编码,并由线粒体的蛋白质合成系统合成。线粒体蛋白质合成系统中的rRNA和tRNA也是mt DNA编码。mt DNA的复制、转录以及蛋白质合成系统均有其本身特点,既与非线粒体真核系统有所不同,又有别于原核细胞中者。因此,线粒体基因组的研究在生物学上有重要意义。此外,线粒体的起源和进化是许多生物学家所感兴趣的和长期争论的问题,而mt DNA的进化比较     

哺乳类线粒体基因组

作为真核细胞的一种重要细胞器的线粒体含有独立的并自主复制和转录的DNA基因组。虽然线粒体蛋白质的大部分系核DNA编码,但有一小部分是线粒体DNA(mt DNA)编码,并由线粒体的蛋白质合成系统合成。线粒体蛋白质合成系统中的rRNA和tRNA也是mt DNA编码。mt DNA的复制、转录以及蛋白质合成系统均有其本身特点,既与非线粒体真核系统有所不同,又有别于原核细胞中者。因此,线粒体基因组的研究在生物学上有重要意义。此外,线粒体的起源和进化是许多生物学家所感兴趣的和长期争论的问题,而mt DNA的进化比较     

Using MutPred derived mtDNA load scores to evaluate mtDNA variation in hypertension and diabetes in a two-population cohort:The SABPA study

Mitochondrial DNA(mt DNA) variation has been implicated in many common complex diseases, but inconsistent and contradicting results are common. Here we introduce a novel mutational load hypothesis, which also considers the collective effect of mainly rare variants, utilising the Mut Pred Program.We apply this new methodology to investigate the possible role of mt DNA in two cardiovascular disease(CVD) phenotypes(hypertension and hyperglycaemia), within a two-population cohort(n = 363; mean age 45 ± 9 yrs). Very few studies have looked at African mt DNA variation in the context of complex disease, and none using complete sequence data in a well-phenotyped cohort. As such, our study will also extend our knowledge of African mt DNA variation, with complete sequences of Southern Africans being especially under-represented. The cohort showed prevalence rates for hypertension(58.6%) and prediabetes(44.8%). We could not identify a statistically significant role for mt DNA variation in association with hypertension or hyperglycaemia in our cohort. However, we are of the opinion that the method described will find wide application in the field, being especially useful for cohorts from multiple locations or with a variety of mt DNA lineages, where the traditional haplogroup association method has been particularly likely to generate spurious results in the context of association with common complex disease.     

Evidence for the paternal mitochondrial DNA in the crucian carp-like fish lineage with hybrid origin

In terms of taxonomic status, common carp(Cyprinus carpio, Cyprininae) and crucian carp(Carassius auratus, Cyprininae) are different species; however, in this study, a newborn homodiploid crucian carp-like fish(2n=100)(2nNCRC) lineage(F1–F3) was established from the interspecific hybridization of female common carp(2n=100)×male blunt snout bream(Megalobrama amblycephala, Cultrinae, 2n=48). The phenotypes and genotypes of 2 n NCRC differed from those of its parents but were closely related to those of the existing diploid crucian carp. We further sequenced the whole mitochondrial(mt) genomes of the 2n NCRC lineage from F1 to F3. The paternal mt DNA fragments were stably embedded in the mt-genomes of F_1–F_3 generations of 2n NCRC to form chimeric DNA fragments. Along with this chimeric process, numerous base sites of F1–F3 generations of 2 n NCRC underwent mutations. Most of these mutation sites were consistent with the existing diploid crucian carp. Moreover, the mt DNA organization and nucleotide composition of 2n NCRC were more similar to those of the existing diploid crucian carp than those of the parents. The inheritable chimeric DNA fragments and mutant loci in the mt-genomes of different generations of 2nNCRC provided important evidence of the mt DNA change process in the newborn lineage derived from hybridization of different species. Our findings demonstrated for the first time that the paternal mt DNA were transmitted into the mt-genomes of homodiploid lineage, which provided new insights into the existence of paternal mt DNA in the mt DNA inheritance.     

人类多种疾病中mtDNA拷贝数的变化

线粒体是细胞能量和自由基代谢中心,在细胞生命活动中发挥着重要作用,而mt DNA拷贝数是决定线粒体功能的重要因素。由于mt DNA缺乏组蛋白的保护和损伤修复系统,又暴露在氧化磷酸化产生的高氧环境中,易受损引起拷贝数变化,从而影响线粒体的功能。大量研究表明,多种疾病的发生发展与mt DNA拷贝数变化密切相关。该文综述了癌症、神经退行性疾病、心脑血管疾病、精神疾病等各种疾病中mt DNA拷贝数的变化情况,以期从中发现疾病相关mt DNA拷贝数的变化规律和调控机制。     

十字花科植物线粒体DNA的提取和纯化

以十字花科植物芸芥 Eruca sativa 、白菜型油菜 Brassica rapa 和甘蓝型油菜 Brassica napus :武39- 1、武4 3- 1、武5 0 - 2为试材,在蔗糖衬垫法分离纯化m t DNA方法优点的基础上,通过4组不同离心力配比,采用差速离心法、改变缓冲液A的成分以及增加缓冲液的用量,建立了一种简便提取十字花科植物mt DNA方法.研究结果表明:分离细胞破碎组织的离心力、分离线粒体的离心力以及纯化线粒体时的离心力分别为10 0 0 g、2 0 0 0 0 g、180 0 0 g时可分离到高产量的线粒体,且在缓冲液A 蔗糖0 .5 m ol·L- 1 ,Tris- Cl5 0 mm ol·L- 1 ,EDTA5 m mol·L- 1 ,BSA 0 .1% ,PVP 0 .5 % ,0 .1%β-巯基乙醇,p H=7.5 中加入0 .5 % PVP可提高mt DNA的产量,经DNA电泳检测、RAPD扩增证明此方法得到的mt DNA可完全达到RAPD标记和其它分子生物学研究的要求.     

与衰老相关的线粒体功能严重缺陷的胞质杂合细胞的分子特征

该研究组先前建立了含有不同年龄组小鼠神经细胞线粒体的胞质杂合细胞株(其细胞核基因组背景相同),发现老年组较年轻组的胞质杂合细胞线粒体总体功能显著降低。为了研究与衰老相关的线粒体功能严重缺陷的胞质杂合细胞的分子特征,该研究采用3个线粒体总体功能极其低下的老年组胞质杂合细胞株(1个正常功能年轻组胞质杂合细胞株作为对照)作为研究对象。首先,证实氧耗水平和ATP合成显著降低(P0.05或P0.01)。然后,对线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)进行了高通量测序,特别是检出突变型比例低的mt DNA异质性突变,并进一步对呼吸链复合体依赖性氧耗进行了检测。测序结果显示,在老年组胞质杂合细胞中mt DNA点突变明显积累。这些突变包括非编码区的3个变异,据DNA保守性分析结果,其中2个(异质性m.15849GT、m.16289AT)可能为有害的;编码区的4个变异,据DNA和氨基酸保守性分析及蛋白质功能预测结果,其中2个(ND5基因的同质性m.12496TC、Cyt b基因的异质性m.15199AT)可能为有害的。进一步研究结果显示,同时具有复合体I亚基ND5(或复合体III亚基Cyt b)突变和2个调控区突变的胞质杂合细胞,其复合体I(或复合体III)依赖性呼吸显著降低(P0.05或P0.01)。综上,发生于老年组胞质杂合细胞的线粒体总体功能异常,其原因可能为,mt DNA调控区和编码区的异质性和同质性突变,以及多重mt DNA突变的累加引起线粒体呼吸链复合体功能的缺陷,进而导致线粒体总体功能异常,从而促进衰老。     

线粒体单体型与线粒体相关的人类疾病

线粒体是一种拥有自身遗传体系的半自主细胞器,它的遗传物质线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)随着人类的迁移、隔离、进化而形成了广泛的线粒体基因组多态性,同一祖先所具有的一些相同mt DNA SNP位点的集合称为线粒体单体型.不同的线粒体单体型会在一定程度上影响线粒体功能,从而影响整个细胞的生长,并在某些情况下导致一些个体的病变,例如Leber遗传性视神经病变、母系遗传性耳聋、Ⅱ型糖尿病、帕金森以及各种癌症等复杂疾病.本文列举总结了几种线粒体相关疾病及其与线粒体单体型如A、B、D、F、G、H、J、K、M、N、T、U、Y及一些有特点的多态位点如G11778A、A1555G、T3394C、G10398A等的相关性.     

尼可地尔预处理对大鼠缺血再灌注心肌mtDNA4834bp片段缺失的影响

目的:探讨尼可地尔预处理对大鼠缺血再灌注心肌mt DNA4834 bp缺失突变的影响。方法:体重200 g-300 g,7-9周龄健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,随机平均分为5组,假手术(Sham)组、心肌缺血再灌注损伤(MIRI)组、缺血预处理(IPC)组、尼可地尔(Nic)组、尼可地尔+5羟基葵酸钠(Nic+5-HD)组。建立心肌缺血再灌注模型后取心肌组织,提取mt DNA,应用巢式PCR法定性检测mt DNA4834 bp片段缺失突变。结果:MIRI组、IPC组、Nic组和Nic+5-HD组突变频率分别为100%、20%、30%和89%。Sham组未检测到mt DNA4834 bp缺失突变。Nic组mt DNA4834 bp片段缺失明显低于MIRI组和Nic+5-HD组(P0.05),与IPC组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:尼可地尔预处理可降低大鼠MIRI后mt DNA4834 bp片段缺失突变,改善线粒体能量衰竭。     

线粒体DNA单体型M8a对转线粒体细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)单体型M8a对细胞线粒体能量代谢的影响,该研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导血小板–细胞融合技术,构建mt DNA单体型M8a和G2a转线粒体细胞(transmitochondrial cytoplasmic hybrid cell,cybrid)模型。后续运用Real-time PCR检测细胞mt DNA拷贝数和RNA转录水平,多功能酶标仪检测细胞活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),线粒体呼吸测定仪检测细胞内源性氧呼吸(oxygen consumption,OC)情况。结果表明,与G2a细胞相比,M8a细胞mt DNA拷贝数和线粒体轻链(L链)转录水平明显降低(P0.01),细胞基础耗氧量、ATP合成耗氧量、最大氧呼吸能力和MMP显著下降(P0.05),细胞ROS水平显著上升(P0.05)。mt DNA单体型M8a细胞的线粒体呼吸功能受损,可能增加了该单体型人群罹患2型糖尿病的风险。     

常见结直肠癌无线粒体DNA细胞株的建立

目的:流行病学研究表明结直肠癌细胞线粒体DNA(mt DNA)拷贝数变异与患者预后具有显著相关性,但因缺乏相关体外细胞模型导致其细胞生物学效应及具体分子机制尚不明确。因此研究建立结直肠癌ρ0细胞株(无mt DNA)的方对该研究域具有重大意义。方法:在含有丙酮酸、尿苷及不同浓度溴化乙锭的培养基中培养大肠癌细胞株SW480、HCT 116、HCT-8,以不加溴化乙锭的细胞为对照,利用实时定量PCR技术监测不同处理组mt DNA拷贝数的变化,并观察结直肠癌ρ0细胞线粒体形态数目及细胞形态的变化。结果:SW480细胞用50 ng/m L EB处理25代后,再以100 ng/m L EB处理14代可成功构建SW480ρ0细胞株;HCT116细胞加用EB 100 ng/m L培养32代,继续用EB 200 ng/m L培养10代,再用EB 500 ng/m L培养3代,可成功获得HCT116ρ0细胞株;HCT-8细胞用200 ng/m L EB培养24代,可成功获得HCT-8ρ0细胞株。同时,ρ0细胞较亲本细胞变大变长,其线粒体的个数增多,线粒体形态变大变长。结论:利用EB处理法可成功构建大肠癌ρ0细胞株,但不同肠癌细胞方法不尽相同。mt DNA拷贝数的降低可显著影响大肠癌细胞的形态。     

线粒体DNA数目不同的人角质形成细胞模型的建立

该研究采用溴化乙锭(ethidium bromide,Et Br)对人永生化角质形成细胞(HaCaT)进行诱导,采用RT-PCR法、MTT法和健那绿染色技术联合鉴定Et Br对HaCaT细胞线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数的影响,建立不同mt DNA拷贝数目的HaCaT细胞模型。结果显示,HaCaT细胞经100 ng/m L和50 ng/m L Et Br分别处理10 d后,细胞形态随着处理时间的延长发生改变,由规则铺路石形状逐渐变圆,某些细胞体积变小,成团生长,细胞膜边缘不光滑,且随着mt DNA数目的减少,细胞增殖速率明显下降。RT-PCR分析结果显示,与对照组相比,50 ng/m L和100 ng/m L Et Br处理10 d的HaCaT细胞中,mt DNA的拷贝数分别减少了52.9%和97.6%[以线粒体DNA脱氢酶1(mitochondrial NADH dehydrogenase 1 gene,ND1)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的比值来表示mt DNA的相对拷贝数变化情况]。健那绿染色显示,对照组HaCaT细胞中可见分散存在的蓝绿色线粒体颗粒,100 ng/m L Et Br处理10 d后的HaCaT细胞中,显微镜下蓝绿色线粒体颗粒明显减少。综上所述,该研究证明了HaCaT细胞可通过Et Br诱导被成功培养成ρ–细胞,且Et Br浓度与HaCaT细胞mt DNA拷贝数的变化在一定的范围内存在着剂量–效应关系。