糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明 ,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因 (Wx)第 1内含子被剪接的效率有关 ,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系 ,构建了蜡质基因启动子 (来自籼稻品种2 32 )、蜡质基因第 1内含子 [来自籼稻品种 2 32 (高直链淀粉含量的品种 )或粳稻品种寒丰 6 36 6 (中、低直链淀粉含量的品种 ) ]与GUS报告基因组成的两种嵌合基因 ,将含有这两种嵌合基因的质粒分别转化进粳性糯稻品种奉糯 5 93中 ,同时还分别转化进非糯性的籼稻品种特青和粳稻品种中花 11中作为对照 ,测定它们的抗性愈伤组织与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明与在非糯性的籼稻和粳稻中一样 ,这两种嵌合质粒在不合成直链淀粉的糯稻中也有相当水平的表达。从此结果可以推测 ,糯稻品种有从嵌合基因的转录本中剪接蜡质基因第 1内含子的正常能力 ,而在糯稻中缺乏直链淀粉可能是糯稻蜡质基因第1内含子中的其它突变所造成的     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3．1和2．1kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上（1）去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;（2）将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中（3．1kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中,低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换。将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第1内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常,从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.     

用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记

用PCR AccⅠ分子标记检测方法 ,检测了来自不同地区的 6 3个栽培水稻品种 (系 )蜡质基因第 1内含子剪接供体 1位碱基是G或是T。另外 ,还测定了这些水稻成熟种子的直链淀粉含量。结果显示该位置是G碱基的水稻品系成熟种子中直链淀粉含量均高于 2 0 % ,该位置是T的均低于 18%。在杂交育种过程中 ,这一分子标记可用于预测水稻植株种子的直链淀粉含量。对高直链淀粉含量的水稻亲本与中等直链淀粉含量的水稻亲本之间 5个籼型杂交组合F2 群体的分析表明 ,蜡质基因第 1内含子 1位碱基是G或是T与水稻种子中直链淀粉含量的高或低是紧密连锁 ,共同分离的。这些结果表明PCR AccⅠ分子标记检测方法可用于选育中等直链淀粉含量的籼稻新品系     

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种２３２蜡质基因第一内含于５’端４３０ｂｐ的ｓｓＲＮＡ分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因经一内含子５’端同样长度的ｓｓＲＮＡ分子。部分变性胶电泳结果表明两种ｓｓＲＮＡ分子的迁移速率不同。将两种ｓｓＲＮＡ分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ｓｓＲＮＡ分子能形成不同的茎－环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行     

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种232蜡质基因第一内含子5’端430 bp的ssRNA分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子5’端同样长度的ssRNA分子。部分变性胶电泳结果表明两种ssRNA分子的迁移速率不同。将两种ssRNA分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ssRNA分子能形成不同的茎-环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行了讨论。     

导入反义蜡质基因改良水稻稻米的食味品质和营养品质

经PCR、Southern blot和稻米GUS检测,蜡质基因反义片段与gus构成的融合基因已整合到8株水稻基因组中,并能正确表达。通过稻米GUS染色追踪分析获得转反义蜡质基因纯合后代。将转基因植株的稻米送农业部稻米及制品质量监督检验测试中心进行糙米蛋白质含量和直链淀粉含量测定。结果显示：（1）在转反义蜡质基因纯合的超2-10粳稻后代中,大多数单株糙米在直链淀粉含量降低的同时,蛋白质含量有不同程度提高,糙米蛋白质含量和直链淀粉含量呈显著负相关关系;（2）对照糙米直链淀粉平均含量和糙米蛋白质平均含量分别为13.4%和9.5%。在转基因植株中,稻米直链淀粉含量最低的为11.4%,而蛋白质含量也相对最高,为13.5%。本试验结果表明在水稻中导入反义蜡质基因不仅能够降低水稻稻米的直链淀粉含量,还有可能提高水稻稻米的蛋白质含量。     

聚合蜡质和抗条纹叶枯病基因水稻的分子标记辅助选择

以高蛋白、抗条纹叶枯病的红米水稻‘Kasalath’和本实验室培育的低直链淀粉含量、株型好、产量高的水稻‘上师大3号’为亲本进行杂交.利用蜡质基因(Waxy)在第1内含子5′端剪切位点上游55 bp处CT重复序列的重复数与直链淀粉含量呈负相关的特性,设计了1对SSR引物,利用与抗条纹叶枯病基因(Stv-b2)紧密连锁的...     

籼稻和粳稻中蜡质基因座位上微卫星标记的多态性及其与直链淀粉含 …

稻米直链淀粉是在由蜡质基因Ｗｘ编码的颗粒结合淀粉合成酶（ＧＢＳＳ）的催化下合成的,最近,在Ｗｘ基因的区段内发现了一段多态性微卫星序列（ＣＴ）ｎ,对７４个非糯籼稻和粳稻材料的（ＣＴ）ｎ多态性进行了分析,并探讨了其与直链淀粉含量之间的关系,在７４个品种（系）中共发现７种（ＣＴ）ｎ片段（Ｗｘ等位基因）邓（ＣＴ）８,（ＣＴ）１０,（ＣＴ）１１,（ＣＴ）１６,（ＣＴ）１７,（ＣＴ）１８,（ＣＴ）１９,在籼粳     

籼稻和粳稻中蜡质基因座位上微卫星标记的多态性及其与直链淀粉含量的关系

稻米直链淀粉是在由蜡质基因Wx编码的颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）的催化下合成的。最近,在Wx基因的区段内发现了一段多态性微卫星序列（CT）n。对74个非糯籼稻和粳稻材料的（CT）n多态性进行了分析,并探讨了其与直链淀粉含量之间的关系。在74个品种（系）中共发现7种（CT）n片段（Wx等位基因）,即（CT）8,（CF）10,（CT）11,（CT）16,（CT）17,（CT）18,（Ch）19。在籼粳亚种间,不同（CT）n的分布存在差异较大：在籼稻中,以（CT）11和（CT）18为主,占92．6％,另有（CT）10和（CT）8各2份,（CT）17型1份;在粳稻中,以（CT）16、（CT）17为主,共占20份材料中的90．0％。在上述74个品种（系）中,以（CT）n表示的Wx基因型对稻米直链淀粉含量的决定系数R2达0．912,也即Wx基因型差异可解释这些材料直链淀粉含量变异的91．2％。还发现6份籼稻材料Wx座位上为杂合的（CT）18／（CT）11,其中2份为推广早籼优质品种浙9248和舟优903,并对其在遗传和育种研究中的意义作了探讨。     

转反义蜡质基因‘湘晴’及其杂交稻米的直链淀粉含量研究

利用根癌农杆菌介导将反义蜡质基因(anti-Waxy)导入三系恢复系湘晴水稻获得转基因植株.从T1代外源基因呈单拷贝整合的转基因湘晴水稻中选取3个稻米直链淀粉含量降低较明显的单株继续种植得到纯合后代.以纯合转基因植株及湘晴水稻(对照)为恢复系分别与寒丰不育系杂交,获得4组杂交稻后代(F2).3个T3代纯合转基因湘晴水稻糙米(T4)直链淀粉含量分别为14.42%、13.96%和14.72%,对照为16.04%;3组由转基因湘晴水稻为父本杂交制种后代(F2)糙米直链淀粉含量分别为14.53%、13.77%和14.64%,对照杂交稻(F2)为16.22%.研究表明,导入湘晴水稻中的反义蜡质基因不仅能够降低湘晴稻米直链淀粉含量,还能够进一步抑制杂交后代的稻米直链淀粉合成.     

杂交水稻直链淀粉含量遗传分析

杂交水稻稻谷是从Ｆ１代杂合体收获的Ｆ２代种子,由于Ｆ２代属分离群体,直链淀粉含量等稻米品质会发生分离现象．本研究选择直链淀粉含量低、中、高的５个亲本配组的５个杂交组合,按单粒分析法分析双亲亲本、Ｆ１和Ｆ２代的种子的直链淀粉含量．结果表明,Ｆ２代呈现１（低）：３（中＋高）孟德尔分离规律．在５个组合的单粒分析中发现分离的Ｆ２代群体呈双峰的连续分布,该现象表明高直链淀粉含量对低直链淀粉含量为不完全显性,除单一基因控制外,还受微效多基因修饰．因此杂交水稻育种工作中,尤其是优质杂交稻新组合选育时,必须注意选择双亲的直链淀粉含量基本一致,以防分离现象影响米质．     

云南软米直链淀粉含量的遗传分析与基因定位

以低直链淀粉( 软米)品种毫木细与高直链淀粉品种桂朝2号杂交F2代分离群体为试验材料,研究水稻低直链淀粉含量的遗传规律和基因定位。结果表明,软米品种毫木细直链淀粉含量受一个隐性主效基因/QTL控制,该基因位点（QTL）与糯性基因(wx)为非等位。除主效QTL外,可能还有微效基因的作用。用SSR标记检测到该主效基因/QTL位于11号染色体上RM224附近,LOD值为15.4,可解释的表型变异率为32%。     

水稻蜡质基因引导区的两个ＳＳＲ序列与直链淀粉含量的相关性

分析了蜡质基因引导区的两个简单重复序列（ＳＳＲ）(ＣＴ）n和（ＡＡＴＴ）n在７４不稻材料中的多态性及其与直链淀粉含量（ＡＣ）的关系。这些材料包括了籼稻（Oryza sativa L.ssp.indica)、粳稻（Ｏ.sativa ssp.japonica)和普通野生稻（O.rufipogon),其ＡＣ值 栽培稻ＡＣ分布的整个范围。以（ＣＴ）n作标记检测到８个等位基因,粳稻品种趋于含有重复数目较多（n≥１６）的等位基因,重复次数较少(n≤１４）的等位基因只出现在籼稻中,（ＡＡＴＴ)n检测到２个等位基因,野生稻中少数植株表现出杂合性。分析表明ＡＣ与这两个ＳＳＲ序列基因型高度相关,高ＡＣ（＞２２．０％）品种具有（ＣＴ）重复次数较少(n≤１４）的等位基因;相反,除了糯米外,所有低或中等ＡＣ的品种都有（ＣＴ）重复较多（n≥１６）的等位基因,具有重复次数较多的（ＡＡＴＴ）６等位基因的品种多为高ＡＣ,具有重复次数较少的（ＡＡＴＴ）５等位基因的品种多为低或中等ＡＣ。不同ＳＳＲ基因型品种间ＡＣ差异极显。虽然目前还不能确定这两个ＳＳＲ序列在直链淀粉合成中的直接功能,ＳＳＲ变异与ＡＣ间近乎完全的相关性可作为分子标记直接用于水稻的品质改良。     

籼爪交水稻F_2群体的蒸煮食味品质研究

分析了籼型高直链淀粉恢复系CG133R与糯性爪哇稻22号杂交衍生的F2群体的蒸煮品质变异及其与淀粉粘滞性特征间的相关性,以及F2群体颗粒结合淀粉合成酶(Wxa基因)和可溶性淀粉合成酶(SSⅡ-3基因)主效基因的遗传。结果表明:蒸煮品质指标和RVA谱特征值在F2群体中广泛分离,其中变异最大的是消减值,其次为胶稠度、直链淀粉含量。高直链淀粉材料各理化指标与RVA谱特征值的相关性不显著;RVA谱特征值在中、低直链淀粉含量和糯稻群体中与各理化指标存在显著或极显著相关;在中、低直链淀粉材料中,RVA谱特征值与糊化温度(GT)也存在显著或极显著相关。用Wxa基因和SSⅡ-3基因的分子标记检测到这两个基因在F2群体中存在偏分离,分别指向两个亲本类型。除高直链淀粉材料外,可以通过RVA谱特征值来辅助筛选优质水稻品种。     

转反义蜡质基因水稻亲本后代性状分析

以单质粒转化的粳稻广粳一号和双质粒共转化的籼稻01早5202所获得的转反义蜡质基因水稻后代为供试材料, 通过潮霉素抗性、PCR检测等手段分析了外源基因的遗传分离特性, 同时, 还分析了转基因材料的直链淀粉含量、waxy蛋白含量的变化特性。结果表明, 无论是采用标记基因(hpt)与目的基因(Anti-sense waxy)连锁的单质粒转化, 还是采用双质粒共转化, 其供试的后代植株材料都发生了外源基因分离现象, 且转基因植株材料的直链淀粉含量都有所下降, 有些单株的直链淀粉含量已降至10%(质量百分比)以下, 远低于对照(其直链淀粉含量为22.04%); SDS-PAGE检测结果显示, 供试的转基因材料的waxy蛋白的含量与对应的直链淀粉含量呈正相关性。     

水稻蜡质基因5‘非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ反应并结合顺序测定,在籼稻２３２蜡质基因编码区５‘上游非翻译区中证明确实存在一个长度为１１２６ｂｐ的内含子,其Ａ＋Ｔ碱基的含量高达６７．４％,它的边界符合真核基因内含子的ＧＴ－ＡＧ规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

软米基因Wx-mp在部分粳稻品种资源中的分布

携带Wx-mp基因的水稻材料直链淀粉含量约为10%,其米饭柔软,富有弹性,深受市场欢迎。为探明该基因在水稻品种资源中的分布情况以及加快该基因利用进程,本研究开发了该基因的功能标记,对我国南方243份粳稻品种资源进行了检测,发现26份品种资源携带Wx-mp基因,其中25份来源于江苏品种和育种中间材料,1份来源于上海;为验证标记检测的准确性,对26份材料进行了重测序,测序结果与标记检测结果完全吻合;对26份材料的直链淀粉含量进行测定,直链淀粉平均含量为9.2%,变异幅度3.3%,直链淀粉含量最低的品种为南粳505,含量为7.3%,直链淀粉含量最高的品种是南粳46,含量为10.6%,以上结果表明,软米基因Wx-mp主要分布在江沪一带。     

Wx基因与SSⅢ-2基因互作对稻米蒸煮食味品质的影响

为了探究蜡质基因(Wx)与可溶性淀粉合成酶Ⅲ-2基因(SSⅢ-2)等位变异对稻米品质的影响,以籼型高直链淀粉恢复系CG133R和糯性‘爪哇稻22’为亲本杂交,在其F3群体选择仅在Wx和SSⅢ-2基因位点存在多态性的单株为材料,分析各基因型材料的理化指标和粘度速测仪谱特征值。结果表明:(1)SSⅢ-2基因为I型时,Wx基因第一内含子多态性对表观直链淀粉含量有极显著影响。SSⅢ-2基因为Ⅱ型时,Wx基因第一内含子多态性对表观直链淀粉含量和成糊温度有极显著影响。(2)Wxa背景下,SSⅢ-2基因对稻米品质无显著影响;Wxb背景下,SSⅢ-2基因对糊化温度和粘度速测仪谱中最高粘度、崩解值、成糊温度有极显著影响。(3)Wx和SSⅢ-2基因共同作用极显著影响水稻表观直链淀粉含量、糊化温度、最高粘度、崩解值和成糊温度,说明Wx和SSⅢ-2基因之间存在互作,且Wx基因对SSⅢ-2基因具有显性上位性,Wx基因大量表达会遮盖SSⅢ-2基因对稻米品质的效应。     

云南软米低直链淀粉含量及其相关性状遗传分析

IR36×八宝米F2单株直链淀粉含量与农艺、米粒外观性状相关性及其遗传分析表明,18个性状有9个性状与直链淀粉含量呈极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)相关性,尤其直链淀粉含量与垩白长(0.353**)、株高(-0.242**)、结实率(0.235**)、第一节间长(0.195**)的相关系数达极显著水平(P＜0.01),直链淀粉含量9%～15%是籼型软米杂种后代的重要指标;八宝米的垩白长和第一节间长均表现部分显性主效基因,籼型八宝米低直链淀粉基因和IR36的矮秆基因均为1对隐性主效基因控制,表明八宝米的优质基因易于转育或表达,可广泛用于水稻优质米育种;用SSR标记将软米基因有关的低直链淀粉含量定位于第6染色体上与RMl90连锁,其遗传距离为18.8cM.