重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展

琥珀酸作为一种优秀的C4平台化合物, 广泛用于生物高分子、食品与医药等行业, 市场潜在需求量巨大。采用微生物发酵法生产琥珀酸, 可利用廉价的可再生资源, 实现石油的原料替代, 而且过程污染小, 环境友好, 且在发酵过程中可吸收固定温室气体CO2, 开辟了其利用的新途径, 近年来引起了广泛关注。在丁二酸生产菌株中, 大肠杆菌由于其遗传背景清楚, 易操作易调 控, 培养基要求简单, 生长迅速等优点, 近年来被广泛用于研究以获得产琥珀酸优秀生产菌株。本工作系统综述了产琥珀酸大肠杆菌构建中所采用的基因工程策略及代谢工程技术, 并探讨了今后研究的方向。     

好氧发酵生产琥珀酸工程菌株的构建

通过分析大肠杆菌的碳源代谢途径, 利用基因敲除手段, 以Escherichia coli MG1655为出发菌株, 成功构建了琥珀酸好氧发酵生产工程菌E. coli QZ1111 (MG1655?ptsG?poxB?pta?iclR?sdhA)。检测结果表明该菌株能以葡萄糖为碳源, 在好氧发酵且不表达任何异源基因的条件下大量积累琥珀酸。摇瓶试验证明, 琥珀酸发酵产量达到26.4 g/L, 乙酸盐作为唯一检测到的副产物产量为2.3 g/L。二者浓度比达到11.5:1。     

大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸的代谢工程研究

目的:对大肠杆菌进行代谢网络改造,考察木糖好氧发酵生产琥珀酸的可行性。方法:以有氧条件下大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸的代谢途径分析为基础,以大肠杆菌BL21为出发菌株,通过P1噬菌体一步敲除法敲除琥珀酸脱氢酶基因(sdhA)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)、丙酮酸脱氢酶基因(poxB)及异柠檬酸裂解酶阻遏物基因(iclR),构建木糖好氧发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌JLS400(△poxB△pta△iclR△sdhA)。将携带磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的质粒pJW225转化到JLS400中。结果:摇瓶发酵结果表明,构建的工程菌能以木糖为碳源,在好氧发酵条件下琥珀酸产率较高,副产物仅有少量乙酸和丙酮酸。结论:基因工程大肠杆菌JLS400pJW225的构建,为有氧条件下以木糖为原料生产琥珀酸的进一步研究奠定了基础。     

大肠杆菌产琥珀酸基因工程研究进展

生物合成琥珀酸摆脱了对不可再生战略资源石油的依赖,以其社会、经济和环境效益展现出良好的发展前景。野生型大肠杆菌的琥珀酸生产强度难以满足生物合成琥珀酸工业化的要求,但遗传背景清楚,容易改造。近年来,人们深入研究了大肠杆菌的琥珀酸代谢途径,通过强化大肠杆菌琥珀酸合成途径、抑制琥珀酸旁路代谢途径、构建产琥珀酸乙醛酸循环和有氧生产体系等多种基因工程策略,对大肠杆菌进行菌株改造和代谢进化筛选,提高了琥珀酸产量。综述了大肠杆菌产琥珀酸的基因工程研究进展。     

大肠杆菌突变株QQS101发酵生产琥珀酸初步研究

琥珀酸是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物。对大肠杆菌focA-pflB ldhA突变株QQS101在严格厌氧条件下生长和葡萄糖代谢能力进行了考察,比较分析了葡萄糖与大肠杆菌混合酸发酵产物的单位碳的还原程度,认为非严格厌氧条件有利于QQS101发酵葡萄糖积累琥珀酸,进一步对有氧生长碳源进行了对比试验的结果表明,以木糖支持有氧生长,QQS101摇瓶发酵39 h消耗葡萄糖37.6 g/L,琥珀酸的产量达到31.01 g/L,摩尔产率为1.258 mol Succinate/mol Glucose。发酵过程中,丙氨酸的添加能够提高琥珀酸的摩尔产率。     

丁醇在大肠杆菌中的生物合成研究进展*

生物丁醇作为一种重要的化学品和石油基燃料的替代品引起了人们的广泛关注。大肠杆菌(Escherichia coli)是生物合成化学品的优良底盘菌株,已在其体内构建了丁醇的生物合成途径。但大肠杆菌合成丁醇存在:(1)代谢通量非最优;(2)辅因子和氧化还原不平衡;(3)丁醇产量和产率低等问题,为此,从高效酶选择、碳代谢流调控、辅因子调控、丁醇生产和工艺等方面已经对丁醇合成途径和丁醇发酵进行了优化。从该角度出发阐述近几年来大肠杆菌生物合成丁醇的研究进展,并展望了利用工程大肠杆菌生产丁醇的研究方向,旨在为应用其进行高效的丁醇生产提供参考。     

丁醇在大肠杆菌中的生物合成研究进展*

生物丁醇作为一种重要的化学品和石油基燃料的替代品引起了人们的广泛关注。大肠杆菌(Escherichia coli)是生物合成化学品的优良底盘菌株,已在其体内构建了丁醇的生物合成途径。但大肠杆菌合成丁醇存在:(1)代谢通量非最优;(2)辅因子和氧化还原不平衡;(3)丁醇产量和产率低等问题,为此,从高效酶选择、碳代谢流调控、辅因子调控、丁醇生产和工艺等方面已经对丁醇合成途径和丁醇发酵进行了优化。从该角度出发阐述近几年来大肠杆菌生物合成丁醇的研究进展,并展望了利用工程大肠杆菌生产丁醇的研究方向,旨在为应用其进行高效的丁醇生产提供参考。     

谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸的代谢工程研究进展

琥珀酸是一种具有重要应用价值的四碳平台化合物。微生物法发酵生产琥珀酸以其社会、环境和经济优势展现出良好的发展前景。谷氨酸棒杆菌被广泛应用于氨基酸、核苷酸等高附加值化学品的工业化生产,在厌氧条件下细胞处于生长停滞状态,但仍能高效利用碳源合成有机酸,通过代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌有望成为理想的琥珀酸生产菌株。结合近年来谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸取得的最新成果,本文综述了构建高产琥珀酸工程菌株的代谢工程策略、底物的扩展利用,并展望了将来的研究方向。     

系统代谢工程改造树干毕赤酵母生产琥珀酸

为提高树干毕赤酵母发酵生产琥珀酸的产量,借助基因组规模代谢网络模型iTL885获得琥珀酸合成的最佳代谢途径为扩增icl1基因和敲除sdh1基因。在此基础上,借助代谢工程策略构建过量表达异柠檬酸裂解酶基因icl1的重组菌株FPLicl、缺失琥珀酸脱氢酶基因sdh1的重组菌株FPLΔsdh和缺失sdh1基因同时过量表达icl1基因的重组菌株FPLΔsdh-icl。结果表明:3株重组菌的异柠檬酸裂解酶活性由0.33 U/mg分别增加为1.6、5.6和6.6U/mg;而琥珀酸脱氢酶活性则从13.8 U/mg分别降为10.7、0.3和0.3 U/mg。在以木糖为C源的培养基中,3株重组菌生产琥珀酸的能力分别是0.30、1.20和1.60 g/L。     

大肠杆菌生产异戊二烯的代谢工程研究进展

异戊二烯作为一种重要的化工原料,主要用于合成橡胶。此外,还广泛应用于医药或化工中间体、食品、粘合剂及航空燃料等领域。利用微生物法生产异戊二烯因具有环境友好、利用廉价的可再生原料、可持续发展等优势而成为当今研究的热点。这里介绍了大肠杆菌生产异戊二烯的代谢途径及关键酶,从代谢工程的角度出发综述了目前为提高大肠杆菌异戊二烯产量所应用到的方法和策略,并对今后的发展方向进行了展望。     

代谢工程改造大肠杆菌合成己二酸

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66的关键前体。目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L;最后,在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到22.3 g/L,转化率为0.25 g/g,生产强度为0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。     

利用CRISPRi挖掘大肠杆菌生物合成D-泛酸的关键基因

【目的】D-泛酸(D-pantothenic acid,DPA)是一种重要的功能化合物,被广泛应用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等领域,具有良好的市场前景及应用。本研究以实验室保藏的大肠杆菌菌株DPAP10为底盘菌株,利用CRISPR干扰(clustered regularly interspaced palindromic repeats interference,CRISPRi)技术,筛选影响工程菌株DPA生物合成的内源性基因靶点。【方法】构建了p Target和pd Cas9的双质粒CRISPRi系统,可以实现对基因单个或组合表达抑制,摇瓶发酵检测基因抑制对DPA合成的影响;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测了基因抑制后的转录水平;通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测了中间代谢物分析代谢通路变化。【结果】成功从126个靶基因中筛选得到5个显著影响DPA合成的关键...     

产麦角硫因大肠杆菌工程菌株的构建与优化

麦角硫因(ergothioneine,ERG)是一种天然的抗氧化剂,广泛应用于化妆品、食品以及医药领域.相比于传统植物提取和化学合成方法,微生物发酵合成麦角硫因具有周期短、成本低等优点,因而受到广泛关注.为构建高产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株,本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)为出...     

Recombinant streptokinase production by fed-batch cultivation of Escherichia coli

Streptokinase (SK) is a specific effective medicine for thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. This study established a process for the pilot production of recombinant streptokinase (r-SK). Engineering bacteria were fermented in a 20-l fermentor to produce r-SK. After simple renaturation and purification, 12.9 g of r-SK with 97.8% of purity and about 10⁵ IU mg⁻¹ of specific activity was obtained, the yield of protein and the recovery of activity were 44.9% and 51%, respectively. Finally, the r-SK was made into about 700 doses of injections for clinical applications.     

大肠杆菌代谢工程改造合成L-高丝氨酸及其衍生物研究进展

l-高丝氨酸及其衍生物(O-琥珀酰-l-高丝氨酸和O-乙酰-l-高丝氨酸)是生物合成l-甲硫氨酸的前体,同时也是合成多种C4化合物(异丁醇、g-丁内酯、1,4-丁二醇、2,4-二羟基丁酸等)和l-草铵膦等的平台化合物。因此,发酵法生产l-高丝氨酸及其衍生物成为近年内研究的热点。然而,利用生物法合成l-高丝氨酸及其衍生物仍存在一些不足之处,如发酵产量不高或糖酸转化率过低等。此外,对l-高丝氨酸及其衍生物合成的总体代谢和调控机制鲜有报道。本文综述了大肠杆菌代谢工程改造合成l-高丝氨酸及其衍生物O-琥珀酰-l-高丝氨酸和O-乙酰-l-高丝氨酸的研究进展,从底物摄取、关键节点碳流分配改造、辅酶NADPH的循环供应以及目标产物的外运输出等方面,系统分析了大肠杆菌全发酵法生产l-高丝氨酸及其衍生物的代谢途径及改造策略,为其后续代谢改造及生物法生产提供一定的研究思路。     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

在大肠杆菌中拓展合成途径合成异胡椒醇北大核心

天然异胡椒醇作为一种植物来源香料,具有很高的经济价值。目前国内外还未见利用大肠杆菌工程菌株转化生产异胡椒醇的报道。【目的】构建工程菌,采用生物合成方法获得天然香料异胡椒醇。【方法】对来自胡椒薄荷的细胞色素P450家族的柠檬烯-3-羟化酶(LIM3H)基因PM2进行改造,截短LIM3H的N端疏水区,分别添加17α短肽或2B1短肽增加其亲水性,采用CO差示光谱法检测LIM3H活性;将N端疏水区截短后的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NADPH-细胞色素P450还原酶基因(trATR)和修饰后LIM3H基因(Modi-LIM3H)融合后表达,最终以柠檬烯为底物进行全细胞转化。【结果】3种N端修饰LIM3H基因均检测到LIM3H表达和异胡椒醇生成,其中17α短肽修饰后的蛋白表达量最高,异胡椒醇产量达到1.94 mg/L。【结论】本研究在大肠杆菌中增加外源LIM3H与ATR,成功催化柠檬烯生成异胡椒醇,为天然异胡椒醇的生产提供了新的方法。     

大肠杆菌胞内半胱氨酸响应型启动子的筛选表征

【目的】半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于化妆品、药品、食品等行业,微生物发酵法合成半胱氨酸已成为当前研究的热点。基于比较转录组学分析等技术,筛选并表征大肠杆菌(Escherichia coli)胞内对半胱氨酸浓度变化显著响应的启动子。【方法】在Escherichia coli W3110培养基中外源添加不同终浓度的半胱氨酸,通过比较转录组学分析筛选转录水平显著响应半胱氨酸浓度变化的基因,融合目标基因的启动子片段与荧光报告基因egfp构建启动子文库,进一步测定不同半胱氨酸浓度条件下,含有不同启动子重组菌的绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)荧光强度。【结果】筛选并挖掘了随着半胱氨酸浓度提高而转录水平显著提升的27个基因,并将基因的潜在启动子片段与荧光报告基因egfp融合构建启动子文库,筛选获得对半胱氨酸变化具备特异性响应的启动子P_E2。最后,对P_E2启动子-35区间隔区域AAAT进行随机突变,最终获得在1-7g/L半胱氨酸浓度范围内特异性响应性能显著提高的启动子P_E2-33。...     

大肠杆菌中转录-翻译耦合的机制

在大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）等原核生物中,转录和翻译往往是耦合的,这种耦合通常表现在转录和翻译的互相调控上,如转录极性、转录衰减和转录-翻译速率的同步。间接耦合和物理耦合是耦合的两种模式。由警报素（alarmone）(p)ppGpp维持的间接耦合可能需要DksA和TufA蛋白的辅助。物理耦合分为NusG或RfaH因子介导的耦合和非因子条件下产生的“碰撞”耦合。响应于压力的转录或翻译的变化会引发几种耦合模式间的相互转变。耦合对于基因正常表达是必要的,其解除将引发转录终止、R环形成、复制-转录冲突、mRNA切割等不利的事件。结构生物学的相关技术已经清晰地展示了部分耦合的表达体（expressome）的结构细节和特征,这些技术联合多组学分析等方法将提供关于耦合的更深层次的见解。重要的是,对耦合的研究或许会为靶向抗菌药物的开发带来新的思路。