CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cas系统几乎存在于所有的细菌和古菌中,是用来抵御外来病毒和噬菌体入侵的获得性免疫防御机制。2012年起CRISPR/Cas9被改造为基因编辑工具,并衍生出一系列高效、便捷的基因编辑工具,迅速在基础理论、基因诊断和临床治疗等研究领域中得到广泛应用。然而,CRISPR/Cas9也存在细胞毒性、脱靶效应和基因插入困难等一些亟待解决的问题,在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。Cpf1是2015年报道的一种新型CRISPR效应蛋白,具有许多与Cas9不同的特性,有利于克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制。本文综述了近两年来对CRISPR/Cpf1的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

CRISPR/Cas9系统的发展及其在动物基因编辑中的应用 *

CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑技术,主要在DNA水平对生物体的遗传信息进行修改,具有强大的基因编辑能力,目前已经被广泛应用于多个领域,包括基因功能研究、构建动物模型、家畜新品种的培育以及基因治疗等。CRISPR/Cas9技术的不断发展为生物学及医学领域的研究带来了革命性的突破,利用该技术构建基因突变小鼠有助于基因功能的研究,对于遗传疾病的治疗等具有重要的参考价值,同时还可以从基因组水平上有效改善家畜动物的生产性能,提高家畜动物的抗病能力。主要介绍了CRISPR/Cas系统的研究历程、结构与分类,详细阐述了CRISPR/ Cas9技术的作用机制及其在动物基因编辑中的应用,探讨了CRISPR/Cas9在基因编辑动物的制备中存在的问题及优化策略,并对其发展前景进行了展望。     

基于CRISPR/Cas9的基因分析方法研究进展

自2012年首次证明了CRISPR/Cas9可以在体外进行DNA切割试验以来,CRISPR技术逐渐在基因编辑研究中获得了迅速的发展,除了应用于基因编辑领域之外,它在基因表达调控、基因成像、基因分析等方面也展现出了巨大的应用潜力。尤其在基因分析领域,CRISPR技术由于其精确的基因识别、室温的反应条件、易设计性和操作性等特色,使得一系列新型的基因检测技术得以发展,并取得了超越常规技术的一些检测参数。本文以Cas9蛋白为对象,综述了近些年来在该领域取得的研究进展。主要论述Cas9蛋白的功能、改造、引导RNA(sgRNA)的设计及其在基因分析方法上的应用。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的EGFP基因定点整合表达

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现EGFP基因在CHO细胞ACTB基因座位置定点整合和表达,建立基于CRISPR/Cas9技术的外源基因定点整合和表达技术。方法:根据CHO细胞β-actin(ACTB)基因起始密码子区基因序列,设计相应CRISPR/Cas9系统,同时构建含有ACTB同源臂和EGFP基因的同源供体载体(donor vector),通过脂质体转染法同时转染CRISPR/Cas9和供体载体,流式分选EGFP阳性细胞,分析基因编辑技术在EGFP基因定点整合和表达方面的可行性。结果:构建了能有效切割CHO细胞ACTB基因的CRISPR/Cas9系统,筛选到EGFP定点整合至ACTB基因座并有效表达的细胞,ACTB基因缺失后由于γ-actin代偿性表达增强,ACTB缺失细胞形态和生长未受影响。结论:单纯依靠基因编辑技术可以实现1 kb以内的基因同源置换,但效率较低,如实现更大片段的外源基因置换,需借助其它实验技术。     

CRISPR/Cas9技术特异杀伤癌细胞——癌症治疗新策略北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术,主要用于基因编辑。最近发现,CRISPR/Cas9技术亦可用于特异性杀伤癌细胞。天然状态下,CRISPR/Cas9系统存在于细菌,其功能是识别并切割入侵病毒或噬菌体的DNA,由此导致病毒或噬菌体死亡。因此,对于细菌来说,CRISPR/Cas9是一种＂基因剪刀＂或＂基因武器＂,是细菌重要的＂免疫系统＂。目前,CRISPR/Cas9系统一般用于对单基因或多基因的敲除或插入,以构建细胞或动物研究模型。     

CRISPR/Cas系统的分类及研究现状

CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域。对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。其中II型CRISPR/Cas系统已被改造成为一个简便、高效的基因编辑工具,并在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改良中得到广泛应用。简述了CRISPR/Cas系统的结构、作用机理及分类情况,归纳总结了CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母和其他丝状真菌中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行了展望,以期为真菌基因编辑研究提供参考。     

CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因相关疾病方面的应用

CRISPR/Cas9系统是细菌体在长期进化过程中抵御病毒或噬菌体DNA的一种适应性免疫系统。尽管近年来的一些基因编辑技术,如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶等已经给基因编辑带来了许多便利,但CRISPR/Cas9系统以其独特的优势,给基因编辑领域带来了革命性的变化。CRISPR/Cas9系统在生物研究、基因相关疾病的治疗、疾病的基因水平研究等多方面都有广泛的应用。综述近年来CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因缺陷疾病方面取得的应用成果,分析慢病毒和腺相关病毒运载基因编辑元件的利弊,并探讨CRISPR/Cas9系统在基因编辑效率方面的影响因素及仍然存在的问题。     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。     

A revolutionary tool: CRISPR technology plays an important role in construction of intelligentized gene circuits

With the development of synthetic biology, synthetic gene circuits have shown great applied potential in medicine, biology, and as commodity chemicals. An ultimate challenge in the construction of gene circuits is the lack of effective, programmable, secure and sequence‐specific gene editing tools. The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) system, a CRISPR‐associated RNA‐guided endonuclease Cas9 (CRISPR‐associated protein 9)‐targeted genome editing tool, has recently been applied in engineering gene circuits for its unique properties‐operability, high efficiency and programmability. The traditional single‐targeted therapy cannot effectively distinguish tumour cells from normal cells, and gene therapy for single targets has poor anti‐tumour effects, which severely limits the application of gene therapy. Currently, the design of gene circuits using tumour‐specific targets based on CRISPR/Cas systems provides a new way for precision cancer therapy. Hence, the application of intelligentized gene circuits based on CRISPR technology effectively guarantees the safety, efficiency and specificity of cancer therapy. Here, we assessed the use of synthetic gene circuits and if the CRISPR system could be used, especially artificial switch‐inducible Cas9, to more effectively target and treat tumour cells. Moreover, we also discussed recent advances, prospectives and underlying challenges in CRISPR‐based gene circuit development.     

CRISPR/Cas9在放线菌合成生物学研究中的应用和发展

放线菌是活性天然产物和抗生素药物的重要来源。利用合成生物学高效地开发其中丰富的天然产物资源,将为加速新药开发奠定坚实的基础。CRISPR/Cas9作为一种多功能基因编辑系统,因其便捷高效而被广泛应用于真核生物的遗传操作。但在原核生物尤其是放线菌中的应用仍处于起步阶段,机遇和挑战并存。本综述总结了目前CRISPR/Cas9系统在放线菌基因编辑和调控,以及活性天然产物的产量提升、生物合成机制解析和资源开发等方面的研究进展。同时,也对该系统在应用中面临的包括重组修复效率低,以及靶向切割效率不足等关键挑战进行了分析,并提出了相应的优化解决方法。随着CRISPR/Cas9在放线菌应用中的不断完善和发展,将极大地推动放线菌的合成生物学研究,促进其中天然产物资源的有效挖掘和应用开发。     

An efficient CRISPR/Cas9 platform for targeted genome editing in rose (Rosa hybrida)

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-related nuclease 9(Cas9) system enables precise, simple editing of genes in many animals and plants.However, this system has not been applied to rose(Rosa hybrida) due to the genomic complexity and lack of an efficient transformation technology for this plant. Here, we established a platform for screening single-guide RNAs(sgRNAs) with high editing efficiency for CRISPR/Cas9-mediated gene editing in rose using suspensio...     

基于CRISPR/Cas系统的黑曲霉基因组编辑技术

黑曲霉Aspergillus niger是有机酸与酶制剂的重要工业生产菌株,以极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性与高食品安全性等优势成为不可多得的细胞工厂。合成生物学与系统生物学的快速发展,不仅拉开了全面揭示黑曲霉细胞工厂高效运转机制的序幕,而且为高效黑曲霉细胞工厂的创建优化提供了新技术体系。作为新一代的基因组编辑技术,基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术为黑曲霉基因组定向改造与基因表达调控带来了革命性突破。本文重点综述该技术在黑曲霉中的最新进展及其在黑曲霉基因编辑与表达调控中的应用,并对其未来发展方向进行展望。     

CRISPR/Cas工具——分子遗传研究的新刃

遗传与变异体现着生命之美和生命之奥妙,前人在不断探求的过程中逐渐形成了严谨的体系和科学的方法——遗传学。在遗传学的研究中基因编辑工具的作用是不可或缺的,近年来发现的CRISPR/Cas系统作为基因编辑工具箱中的新刃,以其特异性强、靶向性好、适用性广的特点迅速成为广大科研工作者研究和开发的热点。并且,在探索生命暗物质的过程中,会有更多的新的CRISPR/Cas系统被发现并应用在遗传研究等领域。为此,本文综述目前CRISPR/Cas系统的最新研究进展,力图从其系统多样性、分子工作机制及遗传研究应用等方面,为广大科研工作者提供一个系统了解CRISPR/Cas系统及其研究现状的窗口,以期为该领域的研究与应用提供一些有益的参考。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在病毒感染疾病治疗中的应用

CRISPR-Cas9基因编辑技术是基于细菌或古细菌CRISPR介导的获得性免疫系统衍生而来,由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA,指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA,诱发同源重组或非同源末端链接,进而实现在目的DNA上进行编辑。病毒通过特异的受体侵染细胞,其基因组在细胞内发生复制、转录、翻译等过程完成其生活周期,某些DNA病毒或逆转录病毒基因组会整合到宿主基因组中。基因治疗是病毒感染疾病治疗的新趋势。因此,基因编辑技术在持续感染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义。文章主要从CRISPR-Cas9作用机制以及在病毒感染疾病治疗中的应用等方面进行了综述。     

利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。     

CRISPR/Cas9技术在微生物研究中的应用进展

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)系统是在细菌和古生菌中发现的一种RNA指导的降解入侵病毒或质粒DNA的适应性免疫系统。由II型CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas9技术已经被开发成一种强大的基因组编辑和表达调控工具,并且广泛应用于基因功能研究、代谢工程和合成生物学等领域。本文从CRISPR/Cas9系统的发现过程、分类、作用原理、在微生物研究中的应用进展等方面进行总结,并展望了该技术的应用前景。     

Delivery of CRISPR/Cas9 for therapeutic genome editing

The clustered, regularly‐interspaced, short palindromic repeat (CRISPR)‐associated nuclease 9 (CRISPR/Cas9) is emerging as a promising genome‐editing tool for treating diseases in a precise way, and has been applied to a wide range of research in the areas of biology, genetics, and medicine. Delivery of therapeutic genome‐editing agents provides a promising platform for the treatment of genetic disorders. Although viral vectors are widely used to deliver CRISPR/Cas9 elements with high efficiency, they suffer from several drawbacks, such as mutagenesis, immunogenicity, and off‐target effects. Recently, non‐viral vectors have emerged as another class of delivery carriers in terms of their safety, simplicity, and flexibility. In this review, we discuss the modes of CRISPR/Cas9 delivery, the barriers to the delivery process and the application of CRISPR/Cas9 system for the treatment of genetic disorders. We also highlight several representative types of non‐viral vectors, including polymers, liposomes, cell‐penetrating peptides, and other synthetic vectors, for the therapeutic delivery of CRISPR/Cas9 system. The applications of CRISPR/Cas9 in treating genetic disorders mediated by the non‐viral vectors are also discussed.