东亚飞蝗UBX结构域包含蛋白基因LmUBX2的克隆和表达分析（英文）

【目的】UBX结构域包含蛋白是p97/CDC48的辅助因子。p97在泛素化相关的多种细胞过程中起着重要的作用,如依赖泛素-蛋白酶体系统的蛋白质降解和同型膜融合等。本研究旨在克隆东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)的UBX结构域包含蛋白基因,分析其组织和发育表达格局,为进一步研究UBX结构域包含蛋白基因的功能奠定基础。【方法】通过分析东亚飞蝗的转录组数据克隆UBX结构域包含蛋白基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在不同发育时期和成虫不同组织中的表达水平。【结果】克隆到东亚飞蝗的一个UBX结构域包含蛋白基因,命名为LmU BX2。LmU BX2开放阅读框长1 020 bp,编码399个氨基酸,预测分子量和等电点分别为37.8 kD a和6.03,与其他UBX结构域包含蛋白的氨基酸一致性为37%~64%,N端和C端分别有一个保守的UBA结构域和UBX结构域。序列比较和系统发育分析发现LmU BX2属于SAKS1亚家族。定量分析发现,LmU BX2在整个生命周期中都有表达,但成虫期的表达水平最高;在检测的所有组织中都有表达,但在精巢和卵巢中表达水平最高。【结论】研究结果说明LmU BX2可能参与东亚飞蝗多种生理过程,尤其可能与东亚飞蝗的生殖有关,但还需深入研究。     

飞蝗发育相关基因Omb的克隆、原核表达及时空表达分析

【目的】本研究克隆飞蝗Locusta migratoria发育相关的optomotor-blind(Omb)基因,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解Omb基因在飞蝗翅发育中的作用及为进一步蝗灾的治理和防治提供新的理论依据。【方法】利用RT-RCR扩增飞蝗Omb基因cDNA序列,采用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用MEGA 6. 0构建昆虫纲分子系统进化树;构建重组表达载体pET-30a/LmOmb,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析Omb基因在飞蝗不同发育时期及成虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得飞蝗Omb基因部分cDNA序列,命名为LmOmb(GenBank登录号:MG867658),其长792 bp,编码264个氨基酸,在第37-219位氨基酸之间存在一个T-box superfamily保守结构域。同源序列比对分析表明Lm Omb与褐飞虱Nilaparvata lugens Nl Omb氨基酸序列一致性为93%。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR结果显示LmOmb基因在飞蝗不同发育时期均有表达,其中胚胎期的表达量最高,进入若虫期后表达量下降,且各龄若虫之间表达量相对平稳。Lm Omb基因在雌性和雄性成虫的胸部、足、腹部和翅中都有表达,且雌性和雄性之间表达量明显不同。【结论】LmOmb基因可能参与了飞蝗的胚胎发育。研究结果为进一步研究飞蝗LmOmb的功能提供了依据。     

东亚飞蝗UBX结构域包含蛋白基因 LmUBX2 的克隆和表达分析

【目的】UBX结构域包含蛋白是p97/CDC48的辅助因子。p97在泛素化相关的多种细胞过程中起着重要的作用,如依赖泛素 蛋白酶体系统的蛋白质降解和同型膜融合等。本研究旨在克隆东亚飞蝗 Locusta migratoria manilensis (Meyen)的UBX结构域包含蛋白基因,分析其组织和发育表达格局,为进一步研究UBX结构域包含蛋白基因的功能奠定基础。【方法】通过分析东亚飞蝗的转录组数据克隆UBX结构域包含蛋白基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在不同发育时期和成虫不同组织中的表达水平。【结果】克隆到东亚飞蝗的一个UBX结构域包含蛋白基因,命名为 LmUBX2。 LmUBX2 开放阅读框长1 020 bp,编码399个氨基酸,预测分子量和等电点分别为37.8 kDa和6.03,与其他UBX结构域包含蛋白的氨基酸一致性为37%~64%,N端和C端分别有一个保守的UBA结构域和UBX结构域。序列比较和系统发育分析发现 LmUBX2 属于SAKS1亚家族。定量分析发现,LmUBX2 在整个生命周期中都有表达,但成虫期的表达水平最高;在检测的所有组织中都有表达,但在精巢和卵巢中表达水平最高。【结论】研究结果说明 LmUBX2 可能参与东亚飞蝗多种生理过程,尤其可能与东亚飞蝗的生殖有关,但还需深入研究。     

东亚飞蝗中肠几丁质酶基因的克隆、序列分析及组织定位

通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)几丁质酶基因 (LmChi)cDNA全序列 (GenBank 登录号：EF092841)。获得的cDNA全长1 604 bp,其中可读框1 452 bp, 编码483个氨基酸。推测其氨基酸序列与18家族昆虫几丁质酶有较高的相似性。与其他几丁质酶一样,东亚飞蝗几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个碳端丝氨酸富集区和一个几丁质结合域。半定量RT-PCR研究表明,LmChi基因只在东亚飞蝗不同发育阶段的中肠组织中表达,而在东亚飞蝗体壁、前肠和后肠均没有发现LmChi基因的转录。     

飞蝗载脂蛋白受体基因LmLPR的表达及功能分析

【目的】载脂蛋白受体(Lipophorin receptor,LPR)在昆虫体内脂类物质的转运中发挥着重要的作用。基于飞蝗转录组数据库获得飞蝗载脂蛋白受体基因LmLPR,分析其基因特性和表达特征,并通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对其生物学功能进行分析,探究LmLPR在飞蝗脂类物质转运中的作用。【方法】基于课题组飞蝗转录组数据库,获得载脂蛋白受体基因,结合飞蝗基因组数据库,获得其全长开放阅读框(ORF)序列,克隆验证后对其编码蛋白序列特性进行分析;利用GENEDOC软件将该蛋白氨基酸序列与其他物种LPR氨基酸序列进行多序列比对,并使用MEGA5.1软件中的Neighbor-Joining方法,将该序列与其它物种的同源序列进行聚类分析;通过RT-qPCR方法对其在5龄第2天飞蝗不同组织部位和不同发育天数表皮中的表达特性进行分析;通过RNAi技术及伊红染色方法对其生物学功能进行分析。【结果】通过克隆和序列分析获得两种飞蝗LPR基因,即长型(LmLPR-L)和短型(LmLPR-S),序列特征分析发现LmLPR-L和LmLPR-S均有1个信号肽,4个表皮生长因子结构域,5个低密度脂蛋白受体YWTD结构域,以及1个跨膜域。不同于LmLPR-L,LmLPR-S在N端比LmLPR-L多一个低密度脂蛋白受体结构域(LmLPR-L含有6个,LmLPR-S含有7个),而在C端缺失38个氨基酸序列。系统进化树分析显示LmLPR-L和LmLPR-S与蜚蠊目德国小蠊BlattellagermanicaBgLPR-L和BgLPR-S聚为一支。RT-qPCR结果显示LmLPR-S在卵巢中高表达,在其他组织部位的表达量较低,而LmLPR-L在翅芽和卵巢中均高表达,在其他组织部位的表达量较低;时期表达显示LmLPR-S和LmLPR-L在蜕皮后表达量均呈现先升高后降低的趋势,分别在第2天和第3天的表达量最高。在4龄期通过RNAi抑制LmLPR的表达后,发现飞蝗能够正常蜕皮,伊红染色结果显示表皮通透性没有显著改变。【结论】飞蝗载脂蛋白受体基因LmLPR主要在翅芽和卵巢中高表达,其下调表达后不影响若虫的正常生长发育以及表皮的通透性。研究结果为深入探究载脂蛋白受体在昆虫表皮脂类物质转运过程中的作用机制提供了基础。     

小麦条锈菌II类几丁质合成酶基因PstChsII的克隆及表达特征

摘要:【目的】克隆小麦条锈菌几丁质合成酶基因PstChsII,分析其在小麦条锈菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PstChsII的cDNA序列和基因组序列,利用不同的生物信息学软件对序列进行分析,运用实时荧光定量技术分析基因在孢子、芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PstChsII基因（Genbank登录号GQ329851）编码区存在15个内含子,开放阅读框长2727 bp,编码908个氨基酸。PstChsII蛋白C端含有7个跨膜螺旋区,N端含多个保守结构域和“QXR     

草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

【目的】克隆绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶(PP5)基因,了解该基因及其编码产物的结构特征和两种产孢模式(微循环产孢和正常产孢)中的表达特征。【方法】通过绿僵菌中PP5基因EST序列与全基因组数据库比对,获得PP5基因DNA序列;通过同源蛋白比对预测PP5基因的DNA结构并设计引物,PCR扩增获取PP5全长cDNA序列;通过在线分析工具及生物软件进行蛋白结构分析。采用实时荧光定量PCR检测PP5基因在两种产孢模式中的表达特征。【结果】PP5基因长2100 bp,含7个外显子和6个内含子;cDNA开放阅读框长为1428 bp(GenBank登录号HQ317137),编码475个氨基酸;一级、二级及三级结构分析均显示较保守的蛋白磷酸酶结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,PP5基因在绿僵菌微循环产孢的不同阶段表达水平具有显著性差异,特别是在孢子接种16、24、32 h高表达,而在正常产孢模式下表达量非常少。【结论】克隆了绿僵菌的PP5基因,详细了解了该基因及其编码产物的结构特征,发现了该基因在微循环产孢孢子形成后期高表达的重要特征,为进一步研究该基因在微循环产孢中的功能奠定了基础。     

家蚕Sox家族基因BmDichaete的克隆与表达分析

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。     

瘤胃细菌GH48家族糖苷水解酶基因多样性

【目的】了解瘤胃细菌第48家族糖苷水解酶基因(GH48)多样性,为木质纤维素高效降解提供新的基因资源。【方法】通过基因序列比对,设计gh48的简并引物;同时提取两个瘤胃样品的总DNA和总RNA,并将总RNA逆转录成cDNA。以总DNA和cDNA为模板,通过PCR扩增分别建立克隆文库并对克隆文库进行测序;对所得序列进行out种类划分和聚类分析。【结果】本研究共得到了455条编码GH48家族蛋白的基因序列,核苷酸序列之间的相似性为58.65%-100%。对序列的进一步分析表明,89%可以作为区分其种类的界定标准。以此为依据确定所得到的基因序列分别编码66种不同的GH48家族蛋白,分别聚为5个相对独立的类群,其中新类群C中OTU65所代表的序列是cDNA克隆文库中的优势序列,分别占两个cDNA克隆文库的36.4%和19.5%。我们的结果揭示瘤胃细菌gh48基因具有丰富的多样性,同时,其中也存在优势表达的GH48家族蛋白。     

辣椒CaPI的克隆与功能分析

【目的】PISTILLATA(PI)基因属于典型的Type II型MADS-box基因家族成员,是ABC(D)E模型中的B类基因,在植物发育过程中起着重要作用,但辣椒PI同源基因功能研究未见报道。探索辣椒PI基因功能,为深入研究植物PI同源基因的功能机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR的方法从一年生辣椒（Capsicum annuum L.）花器官的cDNA中克隆PI同源基因CaPI,并通过生物信息学方法分析其理化性质、亚细胞定位、蛋白结构和系统进化关系;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析基因在辣椒不同组织中的表达特征;构建植物过表达载体35S:CaPI,通过floral-dipping法转化拟南芥。【结果】该基因开放阅读框648 bp,编码215个氨基酸,相对分子质量为25.13 kD。氨基酸多重序列比对表明,CaPI蛋白N端含有“MGRGKIEIKRIEN”保守基序。系统进化树分析证实,CaPI与马铃薯、番茄和矮牵牛的PI同源基因亲缘关系较近。RT-qPCR证实CaPI主要在花中表达,在花萼中表达量最高,其次是花瓣,在雄蕊中低表达,而在雌蕊中几乎不表达。在拟南芥中过...     

猪苓菌丝形成菌核的MAPK基因克隆及表达分析

【目的】克隆药用真菌猪苓MAPK基因并进行生物信息学分析及表达模式研究。【方法】利用5′-RACE-PCR技术从猪苓菌丝中克隆得到MAPK基因全长,利用生物信息学软件推测蛋白的理化性质、结构域;DNA Star对氨基酸进行多序列比对;用MEGA 5.0做进化关系分析;借助实时定量PCR检测基因表达模式。【结果】猪苓MAPK基因的全长cDNA为1 293 bp,其中编码区占1 161 bp,共编码386个氨基酸,推测分子量为43.872 kD,理论等电点为6.68。猪苓的MAPK有MAPK中ERK1/2类型的保守区。系统进化树结果显示猪苓MAPK蛋白属于担子菌类群。实时荧光定量PCR分析结果表明猪苓菌核形成初期,菌核中的MAPK表达量显著高于菌丝组织,随着菌核的快速生长而减少。【结论】猪苓MAPK基因PuMAPK的分子特征为进一步研究其在猪苓菌丝形成菌核过程中的作用奠定基础。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART,多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号：XM＿038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β-catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域...     

大螟热激蛋白83基因克隆及序列分析

【目的】近年来,大螟Sesamia inferens(Walker)对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的重要害虫之一。HSP83家族作为分子伴侣参与生物生长发育并对外界刺激产生响应,对生物功能蛋白质的正确折叠及胁迫信号传递有着重要意义。本研究旨在克隆大螟HSP90家族HSP83基因的c DNA及基因组全长序列,分析其基本特性。【方法】应用RT-PCR及RACE技术从大螟中克隆HSP83基因的c DNA序列;获取基因组序列,进行基因组验证,并与c DNA序列比较分析其有无内含子;进行系统发育分析。【结果】大螟HSP83基因被命名为Sihsp83(Gen Bank登录号:KM077137),长度为2 496 bp,开放阅读框长2 154 bp,编码717个氨基酸,推测分子量为82.6 ku。该基因编码的氨基酸序列中含有5个HSP90家族保守序列,在C-末端存在细胞质定位信号。大螟HSP83基因组序列长度为2 218 bp(Gen Bank登录号:KM077138),不含内含子。在系统发育树中,大螟HSP83与其他夜蛾科昆虫的HSP90家族聚为一支。【结论】获得的大螟HSP83基因是HSP90基因家族成员;大螟的HSP83是细胞质热激蛋白,具有很高的保守性。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43%、37%,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4(GenBank登陆号DQ643829)。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX-4T-2-Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。