基于蜜蜂球囊菌纳米孔测序数据的基因非翻译区延长、SSR位点发掘及未注释基因和转录本鉴定

【目的】利用已获得的纳米孔长读段测序数据完善现有的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis参考基因组注释信息,并对未注释的新基因和新转录本进行鉴定和功能注释。【方法】基于已获得的纳米孔长读段测序数据,采用gffcompare软件将蜜蜂球囊菌全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,进而对参考基因组注释基因的非翻译区(untranslated region, UTR)进行延长。利用TransDecoder软件对蜜蜂球囊菌基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)及相应的氨基酸序列进行预测。通过MISA软件发掘长度在500 bp以上的全长转录本的SSR位点。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr, KOG, eggNOG, Swiss-Prot, Pfam, GO和KEGG数据库进行功能注释。【结果】共对蜜蜂球囊菌的9 481个基因进行了UTR延长,其中5′UTR和3′UTR延长的基因分别有4 744和4 737个。共预测出10 492个完整ORF,其中编码长度分布在0～100和100～200个氨基酸的ORF最多,分别占ORF总数的38.96%和3...     

中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件。通过RT PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7 338 627, 7 003 419和7 434 233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7 289 494, 6 959 880和7 387 756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48 200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。     

基于第三代纳米孔测序技术的东方蜜蜂微孢子虫全长转录组构建及注释

【目的】本研究旨在利用Oxford Nanopore测序技术组装和注释东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的高质量全长转录组。【方法】采用Nanopore PromethION系统对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子进行转录组测序。通过识别每条clean read两端引物鉴定全长转录本序列。利用Blast工具将全长转录本比对Nr, Swiss-Prot, KOG, eggNOG, Pfam, GO和KEGG数据库,获得相应注释信息。分别利用蛋白结构域分析方法CPC, CNCI, CPAT和Pfam对长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)进行预测,获得高可信度lncRNA。利用CPM(counts per million)法计算每一条全长转录本的表达量。【结果】利用Nanopore PromethION系统对东方蜜蜂微孢子虫转录组测序共测得6 988 795条raw reads,经质控获得6 953 469条clean reads,其中包含5 143 999条全长转录本。共鉴定到10 243条非冗余全长转录本,N50和平均读长分别为1 042 bp和89...     

利用全长转录本优化柞蚕基因组注释(英文)

【目的】优化柞蚕Antheraea pernyi基因组注释,更好地扩展其在比较基因组学及品种改良研究中的应用。【方法】对柞蚕进行全长转录组测序分析;经全长转录本与参考基因组比对,鉴定新基因及新转录本,并对这些新基因和新转录本进行功能注释及长链非编码RNAs (lncRNAs)预测。利用大量的蛋白质编码转录本和lncRNAs对柞蚕基因组中基因结构进行修订。最后创建矫正后的柞蚕基因组基因注释。【结果】新发现1 997个蛋白编码基因和3 399个lncRNA基因,分别由2 402个和3 574个全长转录本数据支持。发现柞蚕基因组含25 021个基因,其中19 825个基因是蛋白编码基因,包括7个保幼激素酸甲基转移酶基因。【结论】本研究促进了对柞蚕基因组基因注释信息的认识,为柞蚕及相关物种功能基因组及比较基因组学研究提供了很有用的数据资源。     

结合三代测序与二代测序技术揭示蜜蜂球囊菌孢子转录组的复杂性

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio单分子实时(singlemoleculereal-time,SMRT)测序技术对蜜蜂球囊菌孢子(AaS)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)以及长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)进行鉴定和分析,进而揭示蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性。【方法】采用Suppa软件对蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件进行鉴定。通过RT-PCR对不同类型的AS事件进行验证。采用TAPIS pipeline对蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析孢子全长转录本的poly(A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。联用CPC和CNCI软件和比对Swiss-prot数据库的方法预测lncRNA,取三者的交集作为高可信度的lncRNA集合。进一步比较lncRNA和mRNA的转录本长度,外显子数量与长度,内含子长度,GC含...     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中毒力因子相关全长转录本的鉴定及分析

[目的]蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis是一种专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病的致死性真菌病原.基于前期已获得的高质量纳米孔(Nanopore)长读段测序数据,对蜜蜂球囊菌菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的毒力因子相关全长转录本进行鉴定和分析,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供参考信息和基础.[方法]利用BLAST工具,将AaM和AaS中的所有全长转录本比对Nr数据库,以鉴定蜜蜂球囊菌的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的全长转录本.使用minimap2软件,将AaM和AaS中的全长转录本序列与蜜蜂球囊菌参考基因组注释的已知转录本序列进行比对,将比对到参考基因组的全长转录本进行归一化处理,再通过每百万计数法(Counts per million,CPM)计算毒力因子相关全长转录本的表达量.利用百迈克云平台的相关工具绘制转录本的表达量聚类热图.通过IGV浏览器对部分毒力因子相关全长转录本结构进行可视化.[结果]在AaM鉴定到毒力因子相关的367个基因及407个全长转录本,包括12条几丁质酶相关全长转录本,48条脂肪酶相关全长转录本,289条水解酶相关全长转录本,58条蛋白酶相关全长转录本.在AaS鉴定到毒力因子相关367个基因及400个全长转录本,包括14条几丁质酶相关全长转录本,63条脂肪酶相关全长转录本,267条水解酶相关全长转录本,56条蛋白酶相关全长转录本.另外,AaM和AaS特有的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶)相关全长转录本分别有0条和17条,共有的毒力因子相关全长转录本有60条.进一步分析发现,蜜蜂球囊菌的部分毒力因子基因可通过可变剪接形成多条剪接异构体.[结论]共鉴定到蜜蜂球囊菌毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的367个基因和486条全长转录本;相比于蜜蜂球囊菌参考基因组注释的转录本,绝大多数毒力因子基因对应的全长转录本数量更多且结构更为复杂.研究结果丰富了蜜蜂球囊菌毒力因子相关基因和转录本的注释信息,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供了基础,也为白垩病防控提供了潜在靶点.     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-10660及其靶基因表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-10660调控东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对前期鉴定到的东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-10660进行表达验证，再通过Sanger测序验证nce-miR-10660的序列。利用相关生物信息学软件预测和分析nce-miR-10660的靶基因。通过RT-qPCR检测nce-miR-10660及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中中肠中的表达谱。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果分别证实了nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的表达和真实存在。靶向预测结果显示nce-miR-10660共靶向RRDRP和RCDP 42等9个基因；分别有2和6个靶基因可被分别注释到KEGG数据库中的4条通路和GO数据库中的23个条目。RT-qPCR结果显示，相较于东方蜜蜂微孢子虫侵染后1 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量，东方蜜蜂微孢子虫侵染后2 d时意...     

转录组分析揭示东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂的分子机制

【目的】本研究旨在通过差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)分析以及毒力因子和其他侵染相关因子分析,在转录组水平揭示东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的分子机制。【方法】基于前期已获得高质量的东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)及侵染意大利蜜蜂工蜂7和10 d的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)转录组数据,根据P≤0.05且|log₂(Fold change)|≥1的标准,通过比较分析筛选出NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组的DEG。通过相关生物信息学软件对上述DEG进行Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析。根据Nr和KEGG数据库注释信息和相关文献进行对东方蜜蜂微孢子虫的毒力因子和侵染相关因子的统计和分析。通过RT-qPCR验证转录组数据及DEG表达趋势。【结果】从NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别鉴定出1 397, 1 ...     

东方蜜蜂微孢子虫基因的可变剪接及可变腺苷酸化解析

本研究旨在基于已获得的第三代纳米孔全长转录组数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae基因的可变剪接(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行分析.通过Astalavista软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫基因的AS事件类型...     

蜜蜂球囊菌的参考转录组de novo组装及SSR分子标记开发

【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序,de novo组装球囊菌的参考转录组,并对其进行功能与代谢通路注释,进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子,配制含1×107孢子/m L的饲料饲喂4,5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫,通过Illumina Hi SeqTM2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序,原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes,进而通过BLASTX比对NCBI Nr,Swiss-Prot,KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物,通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads,de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示,29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多,达6 050个。KEGG注释结果显示,unigenes可注释到117个代谢通路,其中富集在核糖体(ribosome)上的unigenes数量最多(529)。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs,通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组,并进行了功能与代谢通路注释,可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。     

越冬西方蜜蜂4个亚种的转录组学差异分析

【目的】为进一步探讨西方蜜蜂Apis mellifera在越冬期基因表达模式的变化规律及抗寒机理,进而更好地指导蜂群越冬管理。【方法】利用转录组学鉴定和比较了西方蜜蜂4个亚种高加索蜂A.m.caucasica、欧洲黑蜂A.m.mellifera、意大利蜜蜂A.m.ligustica和卡尼鄂拉蜂A.m.carnica在越冬期的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并进行了GO和KEGG富集分析。利用qRT-PCR验证转录组测序结果的可靠性。【结果】西方蜜蜂4个亚种在越冬期DEGs的表达量变化各具特点,其中意大利蜜蜂在越冬初期到越冬中期DEGs表达量变化活跃,卡尼鄂拉蜂和欧洲黑蜂在越冬中期到越冬末期DEGs表达量变化活跃,高加索蜂在整个越冬期DEGs表达量相对稳定。越冬初期西方蜜蜂4个亚种的DEGs表达模式存在差异,高加索蜂和欧洲黑蜂中表皮蛋白22、卵黄原蛋白、气味结合蛋白14、热休克蛋白70和细胞色素P4509e2基因的表达量比意大利蜜蜂和卡尼鄂拉蜂的高,意大利蜜蜂中几丁质酶、防御素1、视黄醇脱氢酶和细胞色素b5基因的表达量较高,而卡尼...     

虹鳟肝组织新转录本分析及基因结构优化

目的虹鳟热应激下肝RNA-seq数据中新转录本的分析及已注释基因结构优化。方法以虹鳟肝为材料提取总RNA,构建cDNA文库,并利用Illumina双端测序Hiseq 2500平台进行测序。运用Cufflinks软件对测序数据进行组装,将其与虹鳟参考基因组进行序列比对。结果发掘新转录本6555个,其中30个新转录本在热应激前后差异表达(P<0.05)。与GO数据库比对对新转录本进行功能注释,获得3097个新转录本的注释。与KEGG数据库比对,共有3617个新转录本注释到284条代谢通路中。对19 424个已注释基因的结构进行优化,延伸了14 719个基因的5′端和14 796个基因的3′端。结论通过对发掘的6555个新转录本分析,并对19 424个已注释基因结构优化,为虹鳟基因组注释信息的完善提供了有力的借鉴,并为进一步了解虹鳟热应激的机制提供更有力的理论基础。     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌转录因子、融合基因及RNA编辑事件的鉴定

【目的】本研究旨在利用已获得的PacBio单分子实时(single molecule real-time, SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的转录因子(TF)、融合基因和RNA编辑事件进行鉴定和分析,以期丰富蜜蜂球囊菌的相关信息,并为进一步探究它们的功能提供理论依据。【方法】利用BLASTx工具将AaM和AaS的全长转录本序列比对到Nr, Swiss-Prot和KEGG数据库以获得一致性最高的蛋白序列,再利用hmmscan软件将上述蛋白序列比对到Plant TFdb数据库以获得TF的分类及注释信息。采用TOFU软件中的fusion_finder.py程序进行融合基因的预测,进而分析融合基因的序列和位置信息。使用SAMtools预测AaM和AaS中的RNA编辑事件,再利用ANNOVAR软件对RNA编辑事件进行注释,进而采用相关生物信息学软件对RNA编辑位点基因进行GO功能和KEGG通路注释。【结果】在AaS中共鉴定到17个TF家族的213个TF,其中C2H2家族包含的TF成员最多。在AaM和AaS中分别鉴定到921和510个融合基因,二者共有的融合基因为510个,特有的融合基因分别为411和0个。在AaM和AaS中分别鉴定到547和191次RNA编辑事件,其中AaM中同义单核苷酸突变的数量最多,AaS中非同义单核苷酸突变的数量最多。此外,在AaM中鉴定到12种碱基替换类型,其中发生C->T的RNA编辑事件数量最多,达到158次;在AaS中鉴定到9种碱基替换类型,其中发生C->T和G->T的RNA编辑事件数量最多,均有42次。AaM和AaS中RNA编辑位点基因分别涉及19和24个GO功能条目;此外还能注释到11和20条KEGG通路。【结论】蜜蜂球囊菌的菌丝和孢子中含有丰富的TF、融合基因和RNA编辑位点;转录因子C2H2家族与蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长发育和细胞活动具有潜在关联;RNA编辑事件的碱基替换类型在蜜蜂球囊菌和其他物种中具有物种特异性;RNA编辑可能在蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长和代谢中发挥作用。     

意大利蜜蜂染色体DNA非编码区抗白垩病相关的SNP的筛选与验证

【目的】筛选验证意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica染色体DNA非编码区与抗白垩病相关的SNP。【方法】本研究将蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子接种于人工饲养的意大利蜜蜂3日龄幼虫,根据是否存在白垩病症状进而筛选出抗病个体和易感个体。基于前期重测序结果中意大利蜜蜂第2和11号染色体DNA非编区与抗白垩病相关的SNP信息,利用PCR测序的方法筛选并验证意大利蜜蜂幼虫第2和11号染色体DNA非编码区与幼虫抗白垩病相关的55个SNP。【结果】发现位于意大利蜜蜂第11号染色体LOC100578413基因5′端的非编码区的SNP(T14570310C)在抗病个体中T等位基因频率高于C等位基因频率,且抗病个体中的T等位基因频率显著高于易感幼虫中的T等位基因频率,表明该SNP位点与抗白垩病相关。该分子标记对抗性个体和易感个体的判断结果与前期筛选的编码区SNP(C2587245T)分子标记的结果一致。【结论】筛选并验证意大利蜜蜂第11号染色体DNA非编码区的SNP(T14570310C)与抗白垩病相关。该位点为抗白垩病分子辅助选育提供新的分子标记,在意大利蜜蜂白垩病早期检测和培育白垩病抗性的蜂种方面具有重要意义。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-34537和靶基因PIP5KI的表达谱

【目的】本研究旨在对前期鉴定到的nce-miR-34537进行表达和序列验证,预测nce-miR-34537的靶基因并明确其分子特性,进而检测nce-miR-34537及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为进一步探究nce-miR-34537调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能和作用机制提供基础。【方法】通过Stem-loop-RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-34537的表达和序列。通过生物信息学软件预测nce-miR-34537的靶基因PIP5KI(I型磷脂酰肌醇4-磷酸-5-激酶基因)的理化性质等分子特性和保守基序,并构建基于氨基酸序列的系统进化树。采用RT-qPCR检测nce-miR-34537及其靶基因的表达谱。【结果】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达。nce-miR-34537共靶向PIP5KI等151个基因。PIP5KI蛋白的分子式为C₈₈₂H_{1 364}N₂₂₆     

意大利蜜蜂工蜂中肠的环状RNA及其调控网络分析

【目的】环状RNA(circRNA)在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能。本研究旨在分析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠circRNA的数量、种类、结构特征和作用,并通过构建和分析circRNA的调控网络探索circRNA的调控功能。【方法】在实验室条件下人工饲养意大利蜜蜂工蜂,利用circRNA-seq技术对意大利蜜蜂7和10日龄成年工蜂中肠样品进行深度测序。利用find_circ软件从质控后的数据中预测circRNA。通过BLAST比对GO和KEGG数据库,对circRNA的来源基因进行功能和代谢通路注释。利用TargetFinder软件预测circRNA靶向结合的miRNA及miRNA靶向结合的mRNA,通过Cytoscape v.3.2.1软件对circRNA-miRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络进行构建及可视化。通过设计背靠背引物和线性扩增引物RT-PCR对预测出的circRNA进行验证。【结果】意大利蜜蜂工蜂中肠样品的测序平均得到136 463 071条clean reads,去除rRNA后各样品的anchor reads均在136 779 122条及以上。共预测出10 833个circRNA,长度主要介于15~1 000 nt;上述circRNA的类型丰富,其中已注释的外显子circRNA数量最多,分布在西方蜜蜂1号染色体的circRNA数量最多,其次为8号染色体。CircRNA的来源基因可注释到包括结合、细胞进程和细胞在内的45个GO条目,以及包括内吞作用、内质网蛋白加工及核糖体在内的121条KEGG代谢通路,表明circRNA在意大利蜜蜂工蜂中肠的生长、发育、新陈代谢和细胞生命活动等生物学过程中发挥重要作用。进一步构建circRNA-miRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络,分析结果显示部分circRNA可能作为竞争性内源RNA吸附结合microRNA,从而调控基因的表达水平。最后,对随机选择的3个circRNA的RT-PCR结果验证了其真实存在。【结论】本研究对意大利蜜蜂工蜂中肠中的circRNA进行预测、分析及鉴定。研究结果提供了中肠circRNA的数量、种类、结构特征、作用和调控网络的信息,揭示了circRNA可能通过作用于来源基因和作为竞争性内源RNA在意大利蜜蜂工蜂中肠的生长发育和免疫防御中发挥作用,为深入研究circRNA在意大利蜜蜂中肠发育及胁迫响应过程中的功能奠定了基础。     

中华蜜蜂工蜂cDNA文库的构建及ESTs测序分析

【目的】为了解中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂的抗逆性,构建了中华蜜蜂工蜂的cDNA文库,并对文库质量进行分析。【方法】本研究利用SMART技术构建了中华蜜蜂工蜂的全长cDNA文库。【结果】文库库容为3.6×106 cfu/m L,文库重组率为97%,插入片段长度多数分布在1 000 bp左右。挑取cDNA克隆进行EST测序,共进行了306个成功反应,软件拼接共得到234个单基因簇(Unigene),其中包括207个单拷贝(Singletons)序列及27个重叠群(Contigs)。使用Blastx将这些序列同Gen Bank等数据库进行查询、比对和注释,结果显示141条序列有相关同源性,其他序列没有明显的同源性,这也为我们发现新功能基因提供了可靠依据。【结论】此文库的构建在中华蜜蜂功能基因的分离、克隆、筛选以及基因功能研究等方面具有重要作用。     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中微小RNA的鉴定与分析

【目的】丰富东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的微小RNA(microRNA, miRNA)信息,并为深入探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供理论和实验依据。【方法】基于已获得的small RNA-seq数据,利用生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子中的miRNA进行鉴定和分析。采用茎环反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测已鉴定的miRNA的表达;通过分子克隆与Sanger测序验证miRNA的序列。使用TargetFinder软件预测这些miRNA的靶基因,并对靶基因进行数据库注释。根据miRNA与靶基因的靶向结合关系构建调控网络,再利用Cytoscape软件进行可视化。【结果】在东方蜜蜂微孢子虫孢子中共鉴定到10个miRNA;这些miRNA的长度分布介于21~25 nt,首位碱基表现出U偏向性,每一位碱基的偏向性差异明显。Stem-loop RT-PCR检测结果表明这10个miRNA均真实表达;Sanger测序结果证实了随机选取的其中2个miRNA的序列真实性。共预测出249个靶基因,其中分别有249, 118, 136和3个靶基因可注释到Nr,Swiss-Prot, KOG和eggNOG数据库。此外,分别有134和71个靶基因可分别注释到GO数据库的30个功能条目和KEGG数据库的54条通路。【结论】本研究揭示了东方蜜蜂微孢子虫孢子中miRNA的存在和表达;这些miRNA通过调控潜在靶基因的表达参与孢子的生命活动。     

意大利蜜蜂工蜂中肠的长链非编码RNA的预测、分析及鉴定

【目的】预测、分析和鉴定意大利蜜蜂Apismelliferaligustica工蜂中肠的长链非编码RNA(lncRNA),探究lncRNA的作用。【方法】结合lncRNA-seq技术和链特异性cDNA建库方法对意大利蜜蜂工蜂中肠进行深度测序;利用Perl脚本对原始数据进行过滤;联用CPC和CNCI软件对测序数据进行lncRNA预测,并比较lncRNA基因与其邻近的蛋白编码基因的结构特征;通过RT-PCR对随机选取的lncRNA进行鉴定;利用相关生物信息学软件对lncRNA、的上下游基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析。【结果】意大利蜜蜂工蜂中肠样品的lncRNA-seq共得到1 956 118 858原始读段,经过滤得到1 946 489 304有效读段,共预测出6 353个lncRNA,它们较蛋白编码基因含有较少的外显子数、较短的转录本长度。通过RT-PCR验证了9个lncRNA的表达。lncRNA的上下游基因富集在42个GO条目和256条代谢通路,进一步分析结果表明这些lncRNA参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠的新陈代谢和细胞生命活动等生物学过程。【结论】研究结果丰富了蜜蜂的lncRNA信息,也为阐明lncRNA在意大利蜜蜂工蜂中肠发育及胁迫响应过程中的作用打下了基础。     

基于PacBio Iso-Seq红棕象甲全长转录组测序分析

[目的]建立红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus全长转录组数据库,深入挖掘红棕象甲基因数据信息.[方法]采用高通量测序平台,利用二代测序(Illumina RNA-seq)校正三代测序(PacBio Iso-Seq)的方法对红棕象甲进行全长转录组测序,并对转录组数据进行生物信息学分析.[结果]红棕象甲全长转录组平均长度为2 302 bp,N90长度为1321 bp,N50长度为2 785 bp;经CD-Hit程序去冗余,获得转录本63 801条,主要长度范围为0.5-6 k.基因功能注释表明,在NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、GO、NT和Pfam数据库中,分别有50 280、40 109、47 197、33 511、27 707、27 253和27 707条转录本被注释;其中,12 508条转录本均在7个数据库中有注释,54 999条转录本至少在一个数据库有注释.此外,经鉴定或预测,获得2 184个可变剪接(AS)、66 230个SSR、2 084个转录因子(TFs)和9 618条长链非编码RNA(LncRNA).CDS长度的主要分布范围为0-2 500 nt.[结论]本研究获得了红棕象甲全长转录组数据库,为红棕象甲后续分子生物学基础研究奠定基础.