FTL-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建小鼠铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)真核表达载体并检测其表达。[方法]利用PCR扩增技术得到小鼠560 bp的FTL基因编码序列,将此序列插入到含有增强型绿色荧光基因EGFP的真核表达载体PEGFP/N1多克隆位点区域中的限制内切酶HindⅢ和Bam HⅠ之间,得到真核表达载体m FTL-PEGFP/N1。经酶切和测序鉴定后,将构建成功的m FTL-PEGFP/N1及其对照空载体PEGFP/N1分别转染到小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用免疫印迹技术检测细胞中带有PEGFP标签的FTL蛋白的表达。[结果]新构建的m FTL-PEGFP/N1重组质粒经酶切鉴定得到预期片段,进一步的测序结果显示所构建的重组质粒中插入的小鼠FTL基因的c DNA序列正确。[结论]利用分子克隆技术获得了带有绿色荧光蛋白标签的小鼠铁蛋白轻链真核表达载体m FTL-PEGFP/N1,并在细胞中表达良好。     

人Notch受体胞内区基因N2ICD和N3ICD克隆及真核表达体系的构建

Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体N2ICD/pEGFP和N3ICD/pEGFP,将序列正确的重组质粒转染HeLa细胞,显微镜下可见明显的绿色荧光,并定位在细胞核内。Western blotting检测目的蛋白成功融合表达,并能够提高其下游靶基因Hes1的转录活性。     

双报告基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶共同高效表达的双报告基因真核表达载体。方法:将增强型绿色荧光蛋白基因和海肾荧光素酶基因以昆虫病毒T2A序列相连接而后克隆进入pcDNA3.1(-)质粒,构建双报告基因真核表达载体。将该载体转染至COS-7细胞,通过荧光显微镜观察、照度计定量分析检测绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶生物活性,Western Bolt检测T2A序列自剪切效率。结果:双报告基因真核表达载体能够同时表达非融合的绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶,与单独表达载体产物具有相似的生物活性和表达效率。结论:双报告基因真核表达载体建立成功,为基因表达调控等相关领域研究提供辅助工具。     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析

旨在构建带Flag标签的人RhoB基因真核表达载体并检测其表达。提取人胚肾细胞HEK-293T总RNA并反转录获得cDNA;设计引物并利用PCR技术扩增RhoB基因的ORF序列;将所扩增序列插入到带Flag标签的pCMV5真核表达载体,插入位点位于限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间,得到真核表达载体Flag-RhoB。酶切并测序验证该质粒的准确性。将成功构建的Flag-RhoB质粒转染乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞以及结直肠癌HCT116细胞,Western Blotting检测RhoB蛋白的表达情况;转染Mv.1.Lu细胞,免疫荧光技术检测该蛋白在细胞中的定位情况。成功扩增出RhoB基因的ORF序列;连入pCMV5中获得真核表达质粒Flag-RhoB;酶切鉴定得到590 bp大小的片段,测序结果显示连入的是RhoB基因的cDNA序列与GenBank相符。Western Blotting结果显示,该质粒可在MCF7细胞、HeLa细胞及HCT116细胞中正确表达。免疫荧光实验显示过表达的RhoB蛋白主要定位于细胞膜上,细胞质中也有分布。成功构建了带Flag标签的人RhoB基因的真核表达载体,该质粒可在细胞中顺利表达。     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

T7噬菌体转运真核表达载体入胞表达平台的构建

[目的]构建携带锚定序列的真核表达载体,研究T7噬菌体识别、包裹和转运真核表达载体进入细胞实现蛋白表达的可行性,为DNA疫苗研发建立新的技术平台.[方法]本研究通过重叠延伸PCR方法获得候选锚定序列并插入真核表达载体;建立荧光定量PCR方法比较T7噬菌体识别、包裹真核表达载体的效率;激光共聚焦显微镜观察T7噬菌体转运真...     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

铁蛋白轻链真核表达载体的构建

目的:为进一步研究铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的表达对细胞内信号转导途径的影响提供平台。方法:利用PCR扩增技术得到小鼠552 bp的FTL基因编码序列,并在基因的C端引入Flag标签,将此序列插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点区域中限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ之间,得到带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。分别经酶切和测序鉴定。用脂质体lipofectamineTM2000将构建成功的pcDNA3-FTL-Flag及其对照空载体pcDNA3分别转染到RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用Western blot方法检测细胞中带有Flag标签的FTL蛋白表达。结果:重组质粒酶切鉴定得到预期片段,测序结果显示所构建的小鼠FTL基因的cDNA序列正确,并在细胞内检测到分子量约为21kDa的蛋白的强烈表达信号。结论:实验成功构建小鼠FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。     

B19病毒XA株VP1独特区真核表达系统的建立及鉴定

目的:克隆B19病毒XA株VP1u基因,构建真核重组表达载体.方法:从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体plRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u.将其转染至HeLa细胞,提取细胞总蛋白,用Western blot技术检测VP1u蛋白的表达.结果:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u,荧光显微镜下可见pIRES2-EGFP-VP1u转染HeLa细胞后表达EGFP蛋白而发出绿色荧光,Western blot证明VP1u蛋白在HeLa细胞中表达.结论:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u并在HeLa细胞中正确表达,为今后B19病毒VP1u基因疫苗的研究奠定基础.     

细胞周期蛋白B1、D1和E真核表达载体的构建及表达

目的：为研究细胞周期蛋白（cyclin）在肿瘤形成过程中的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白B1、D1、E的真核表达载体,并检测其在293T细胞中的表达。方法：以乳腺cDNA文库为模板,分别扩增细胞周期蛋白B1、D1、E基因全长编码区序列,克隆到pcDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染293T细胞,检测细胞中的FLAG融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-Cyclin真核表达载体,Western印迹分析表明克隆的载体都能在真核细胞中表达分子大小相符的重组蛋白。结论：构建了FLAG-CyclinBl、FIAG-CyclinDl、FLAG-CyclinE真核表达载体,为细胞周期蛋白及其相关蛋白的研究奠定了基础。     

P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因,p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI,构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列,长度为2659bp,SN基因片段1918bp,TD基因片段741bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段,将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒;P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

重组pEGFP—C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达

目的将6个不同的p100-TSN．Mutants基因片段分别定向连入PEGFP—C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础。方法利用EcoR I和Xho I双酶切方法从6个pcDNA3．1（＋）-p100-TSN．Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN．Mutants的cDNA片段,将其连人pEGFP—C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN．Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论①6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants重组质粒构建成功;②p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达。     

鸡贫血病毒VP1和VP1蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与CunI酶切线性化的亲本病毒Bm-Bacpak6DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCC－MSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒（Recombinant BmNP)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达

目的：研究CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达。方法：以质粒pBS1761为模板扩增TAP-tag片段,PCR产物经纯化后克隆在真核表达载体pTRE2-hyg上。再以pUK-CPSF30k、73k、100k为模板扩增CPSF基因片段,将其克隆在质粒pTRE2-hyg-TAP-tag中TAP-tag片段的下游,并将重组质粒转化入细胞株Hela Tet-offS3细胞内。结果：细胞抽提液经SDS PAGE电泳后进行蛋白质印迹杂交,胶片上出现野生型的CPSF条带和分子量较大的滞后条带。后者经分子量与分子标记对照,确系重组体TAP-tag-CPSF所表达的蛋白条带。结论：重组质粒pTRE2hyg-TAP-tag-CPSF30k,73k,100k在Hela tet-offS3内完好表达。     

Expression and bioactivity of recombinant segments of human perforin.

The aim of the study was to prepare an active recombinant human perforin by comparing 5 candidate segments of human perforin. Full-length perforin, MAC1 (28-349 aa), MAC2 (166-369 aa), C-100, and N-60 of human perforin were selected as candidate active segments and designated, respectively, HP1, HP2, HP3, HP4, and HP5. The target genes were amplified by PCR and the products were individually subcloned into pGEM-T. The genes for HP1, HP2, HP3, and HP5 were subcloned into pET-DsbA, whereas pET-41a (+) was used as the expression vector of HP4. The fusion proteins were expressed in Escherichia coli BL21pLysS(DE3) and purified using nickel nitrilotriacetic acid (NTA) agarose affinity chromatography. The hemolysis microassay was used as an activity assay of fusion protein. From this study, we obtained the recombinant plasmids pGEM-T-HP1, -HP2, -HP3, -HP4 and -HP5, consisting of 1600, 960, 600, 300bp, and 180, respectively. From these recombinant plasmids, expression plasmids were successfully constructed and expressed in E. coli BL21pLysS(DE3). The resultant fusion proteins, affinity purified using Ni-NTA, were approximately 80, 58, 45, 44, and 30 kDa, respectively. The recombinant proteins were assayed for activity on hemolysis. HP2 and HP5 were the only recombinant proteins that were active in hemolysis, and the hemolytic function was concentration dependent. These results demonstrate that active recombinant forms of perforin can be synthesized in a prokaryote model. The recombinant N-60 and MAC1 (28-349 aa) of human perforin have the function of forming pores. Our study provides the experimental basis for further investigation on the application of perforin.     

两种血吸虫病DNA疫苗的候选抗原基因研究

目的：以日本血吸虫基因SjFABP和SjGST原核表达产物检测二价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP-SjGST在体内诱发的特异性抗体。方法：克隆日本血吸虫抗原基因SjFABP和sjGST,构建重组原核表达载体pET30a-SjFABP、pET30a-SjGST及真核表达载体pVIVO2-SjFABP-SjGST;将pET30a-SjFABP和pET30a-sjGST进行原核表达,并将表达产物用镍亲和柱分离纯化;采用Western印迹对日本血吸虫DNA疫苗pVIVO2-SjFABP-SjGST免疫4周后的BALB／c小鼠血清进行特异性抗体检测。结果：克隆了日本血吸虫抗原基因SjFABP（399bp）和町GST（657bp）,并构建了pET30a-SjFABP、pET30a-SjGST及pVIVO2-SjFABP-SjGST重组质粒;经Western印迹检测,pET30a-SjFABP及pET30a-SjGST原核表达的抗原蛋白均能够与经日本血吸虫二价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP-SjGST免疫的小鼠的血清产生特异性免疫反应。结论：日本血吸虫町尉即和町GST基因的原核表达系统成功建立;原核表达的抗原蛋白具有免疫原性;以原核表达产物可检测日本血吸虫DNA疫苗pVIVO2-SiFABP-SiGST在体内诱发的特异性抗体。     

北京地区两株人偏肺病毒M蛋白基因的原核表达及抗原活性分析

人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是最近发现的可引起人类呼吸道感染的一种副粘病毒,现被归类于偏肺病毒属(Metapneumovirus),是至今发现的第一个与人类疾病相关的偏肺病毒属成员[1]。目前已经受到世界范围的重视,已有十多个国家报道了不同年龄组人群中hMPV的感染情况。     

重组泛素连接酶PTB-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶PTB-U-box、PTB-RING,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶IGF-IR,抑制肿瘤细胞生长提供基础.方法 分别设计引物,扩增接头分子IRS-1的PTB结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U-box、Cbl的RING结构域,再利用重组PCR,将PTB分别与U-box、RING进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG-CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HeLa细胞,Western 印迹验证重组质粒的表达.结果 PCR结果显示PTB-U-box条带大小840 bp,PTB-RING大小为620 bp,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论 成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box和 pFLAG-CMV4-PTB-RING,并且转染HeLa细胞后证实其能够正确表达.     

A convenient and robust method for construction of combinatorial and random mutant libraries

Here we describe a convenient and robust ligase-independent method for construction of combinatorial and random mutant libraries. The homologous genes flanked by plasmid-derived DNA sequences are fragmented, and the random fragments are reassembled in a self-priming polymerase reaction to obtain chimeric genes. The product is then mixed with linearized vector and two pairs of flanking primers, followed by assembly of the chimeric genes and linearized vector by PCR to introduce recombinant plasmids of a combinatorial library. Commonly, it is difficult to find proper restriction sites during the construction of recombinant plasmids after DNA shuffling with multiple homologous genes. However, this disadvantage can be overcome by using the ligase-independent method because the steps of DNA digestion and ligation can be avoided during library construction. Similarly, DNA sequences with random mutations introduced by error-prone PCR can be used to construct recombinant plasmids of a random mutant library with this method. Additionally, this method can meet the needs of large and comprehensive DNA library construction.