家蚕促前胸腺激素与胰岛素同源——昆虫脑激素研究的最新进展

1984年12月在《科学》(Science,226:1344)杂志上发表了日本东京大学农业化学系长泽宽道博士等人的论文“家蚕促前胸腺激素氨基端氨基酸顺序:与胰岛素同源”。文章写到,能激活内分泌器官前胸腺并使其合成和释放蜕皮素的脑激素——促前胸腺激素(PTIH)已经从家蚕蛾头内提取纯化出来。它包括两类分子量不同的激素,22 K PTTH(分子量～22,000)和4K PTTH(分子量～4400),4 K PTTH有三种4 KPTTH-Ⅰ,-Ⅱ和-Ⅲ。它们氨基端的19个氨基酸顺序已经排定(图A)。     

昆虫激素和抗激素类在蚕业上的应用研究进展

控制家蚕幼虫蜕变和变态的内分泌系统是脑一咽侧体一前胸腺。咽侧体分泌的保幼激素（JH）和前胸腺分泌的蜕皮激素（MH）调节着家蚕的幼虫蜕皮、变态等生命现象,而脑分泌的促咽侧体激素和促前胸腺激素又控制着这两种腺体的分泌活动。家蚕的MH和JH的化学结构早在60年代中期被先后阐明,70年代后对这两种主要激素在血淋巴中的浓度已能精确定量,从而阐明了发生幼虫蜕皮和变态的激素环境。与此同时,发现了一些天然化合物能影响家蚕正常的内分泌活动,导致早熟变态和其他生理变化（如体色变化、生有障碍等）,称之为抗激素类物质。家蚕内分…     

天蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

天蚕卵黄原蛋白cDNA的全碱基序列由5 720个碱基构成,一个开读框有5 334个碱基序列,编码了包括由15个氨基酸组成的信号肽在内的共1 778个氨基酸的蛋白质前体。天蚕和柞蚕卵黄原蛋白的同源性非常高,氨基酸序列达到92.6%,碱基序列达到94%。天蚕、柞蚕和家蚕的卵黄原蛋白的糖链附加位点(N-linkedg-lycosylationsite):柞蚕有4个,家蚕有5个,天蚕和家蚕相同保存着5个。在N-末端区域,天蚕和家蚕有多聚丝氨酸区域和可被胰蛋白酶识别的RSRR部位;柞蚕虽然也具有多聚丝氨酸区域,但没有可被胰蛋白酶识别的RSRR部位。在C-末端区域里,大多数昆虫从G ICG功能部位至C-末端结尾具有7个~10个半胱氨酸(Cys)。鳞翅目的4种昆虫柞蚕、天蚕、家蚕和舞毒蛾(A.pernyi,A.yam am ai,B.m ori,L.dispar)都是7个半胱氨酸。     

桑蚕促前胸腺激素的作用与前胸腺分泌活动的某些特点

本工作以前胸腺的体外器官培养技术和蜕皮激素的放射免疫分析法(MH-RIA)相结合,研究了桑蚕(Bombyx mori)促前胸腺激素(PTTH)的作用与前胸腺分泌的某些特点。结果表明,被PTTH激活后的前胸腺,在一定的时相过程内合成并分泌脱皮甾类激素;前胸腺本体不积累蜕皮甾类激素;PTTH对前胸腺的作用是积累性的;五龄不同天数的前胸腺合成分泌脱皮甾类激素的能力不同,并有不同的剂量反应。     

东方粘虫末龄幼虫血淋巴蜕皮甾类滴度的变化及促前胸腺激素对前胸腺的活化作用

东方粘虫六龄幼虫血淋巴蜕皮甾类滴度,在幼虫的取食生长期一直处在很低的水平(<6pg/μl血淋巴),其后于徘徊期的前一天开始升高,至预蛹期形成唯一的1个高峰(～450pg/μl血淋巴)。前胸腺离体培养的结果表明,前胸腺分泌活力与血淋巴蜕皮甾类滴度的动态呈基本平行的趋势,只是较后者超前了约24小时。促前胸腺激素粗提物能直接活化离体前胸分泌蜕皮甾类。粘虫六龄2日龄(LVI_2)幼虫的前胸腺已能被促前胸腺激素活化,说明此时的前胸腺对促前胸腺激素已具感受性。     

苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达

促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)是一类重要的昆虫激素,它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具有重要调控作用。以苜蓿夜蛾5龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列,该序列含有823个碱基,包括1个681个碱基的开放阅读框,编码1个含226个氨基酸的蛋白,分子量约为26.3 kD,等电点为8.51。序列分析表明,苜蓿夜蛾PTTH的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目夜蛾科昆虫的PTTH高度同源。获得的基因已登录GenBank,登录号为JF731347。利用原核表达载体pET21b在大肠杆菌中成功表达了苜蓿夜蛾PTTH基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化。     

激素和活性多肽

<正> 852871大鼠脾β-4胸腺素(一种可能的胸腺激素)互补D N A的克隆及序列分析[英]/Wodnar Filipowicz,A.…//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-1984,81(8).-2295～2297[译自D B A , 1984,3(16),84-07556]用互补DNA的分子克隆已确立了大鼠脾β-4胸腺素的mRNA可翻译部分的序列,     

家蚕末龄幼虫发育期血淋巴4K-PTTH滴度的测定

<正> 已经查明,在家蚕脑内存在着两类化学结构上和生物功能上不同的促前胸腺激素4K-PTTH和22K-PTTH。鉴于所提取的家蚕4K-PTTH是在蓖麻蚕无脑蛹上进行生物测定,人们要问4K—PTTH究竟与家蚕本身的发育有无关系。现在有必要澄清如下问题:(1)4K-PTTH是否进入血淋巴;(2)如果进入血淋巴,何时释放,以什么方式释放;(3)它起什么作用。 到目前为止,还没有找到一种方法能直接地测定血淋巴内4K-PTTH水平。以前有关脑和血淋巴内PTTH滴度的资料通常是由结扎实验和移植整脑或脑匀浆体内实验推论而来     

胰岛素信号转导、昆虫发育与老化

胰岛素及其信号转导的探讨为当代生物学一大热点,研究显示:从线虫到果蝇、小鼠及其人类其胰岛素信号转导路径十分类似。昆虫胰岛素的研究开始于家蚕,在20世纪80年代,日本学者在分离家蚕促前胸腺激素(prothoracictropic hormone,简称PTTH)时,发现所纯化的为一称为家蚕素的神经激素,该激素之氨基酸排列顺序与高等动物体内的胰岛素部分相似,但是家蚕素的生理功能至今仍不是很清楚。而果蝇的分子遗传学研究则显示,胰岛素及其信号转导调控果蝇的生长、发育、寿命等许许多多的生理现象。专一性地改变果蝇前胸腺之胰岛素信号转导,会严重影响幼虫的蜕皮与变态。而作者利用家蚕所进行的研究更显示,将牛的胰岛素注射于家蚕幼虫体内可显着提高其蜕皮激素的分泌,离体培养前胸腺时加入牛胰岛素也可直接增加其激素的分泌,牛胰岛素可直接活化家蚕前胸腺细胞之胰岛素受体及信号分子Akt的磷酸化。另外,从线虫、果蝇到小鼠胰岛素及其信号转导突变体的研究结果显示了胰岛素信号转导调控寿命的重要性。利用猴子及人所进行的研究结果显示,低卡路里摄取之所以会延长寿命是因为卡路里的摄取与胰岛素信号转导的变化有关。因此,不同物种利用相同的胰岛素信号转导通路调控发育及老化机制,该发现大大鼓舞了科学家们利用低等的生物来研究复杂的生命现象。     

花鳗鲡脑cDNA文库的构建及GnRh日基因克隆与表达分析

以花鳗鲡脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建试剂盒构建cDNA文库.经检测,文库的滴度为4.3×106 cfu/mL,总容量为5.16×107cfu/mL,阳性克隆率为99.6%,插入片段0.43-3.2kb之间,平均插入片段大小为1532bp.以文库为模板,克隆获得花鳗鲡两种类型的促性腺激素释放激素(mGnRH和cGnRH-Ⅱ)cDNA序列.序列分析表明,花鳗鲡mGnRH cDNA开放阅读框(ORF)包含276个碱基,编码91个氨基酸,其中包括22个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1-22位氨基酸)、mGnRH十肽(23-32位氨基酸)、一个三肽裂解位点(33-35位氨基酸)和56个氨基酸的GnRH相关肽(36-91位氨基酸);花鳗鲡cGnRH-Ⅱ cDNA开放阅读框包含264个碱基,编码87个氨基酸,其中包括24个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1-24位氨基酸)、cGnRH-Ⅱ十肽(25-34位氨基酸)、一个三肽裂解位点(34-36位氨基酸)和50个氨基酸的GnRH相关肽(37-87位氨基酸).序列同源性分析表明,花鳗鲡mGnRH、cGnRH-Ⅱ cDNA与日本鳗鲡之间的相似性率高达98%;与鲑形目、鲈形目、鲽形目鱼类的相似率为73%-78%;而与鲤形目鱼类的相似性相对较低(63%-67%).采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在花鳗鲡雌雄个体中的表达,结果表明两基因在雌雄个体的组织表达模式无明显差异;但mGnRH基因在雌雄个体内表达部位多于cGnRH-Ⅱ的.     

甜菜夜蛾促前胸腺激素cDNA的克隆和表达

利用兼并引物扩增出甜菜夜蛾(Spodoptera exigua, Spe)的促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone, PTTH) cDNA, 克隆和测序结果显示出PTTH cDNA编码226个氨基酸的开放阅读框: 包括信号肽、1个功能未知的肽和PTTH. 和其他已知物种的PTTH比较, 甜菜夜蛾和夜蛾科昆虫有较高的同源性, 和蚕蛾科和大蚕蛾科昆虫的相似性稍低, 但是PTTH分子中的7个半胱氨酸残基的位置是非常保守的. 整体免疫组织化学检测发现PTTH表达在甜菜夜蛾脑中的2对神经分泌细胞中. Northern杂交表明在脑中有高丰度的PTTH mRNA存在, 分子大小约为1.2 kb. 半定量RT-PCR检测了PTTH在幼虫期和蛹期的发育变化, 显示出PTTH表达和蜕皮变态有密切的关系, 暗示PTTH在甜菜夜蛾行使其生物学功能很可能是通过刺激前胸腺合成和分泌蜕皮激素来完成的.     

亚洲玉米螟末龄幼虫促前胸腺激素与蜕皮甾类激素滴度的变化

用放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)以12小时间隔测定了亚洲玉米螟Ostrinia tfurnacalis末龄非滞育幼虫血淋巴中蜕皮甾类激素滴度.通过前胸腺体外培养,以12小时间隔测定了前胸腺体外分泌活性的变化.发现二者的变化在相同发育阶段是一致的.在亚洲玉米螟上建立了促前胸腺激素(PTTH)体外测定法,并用此法以24小时间隔测定了末龄幼虫脑和血淋巴中PTTH滴度.发现血淋巴中PTTH滴度在末龄第5和7天各有一高峰,脑中只在第5天有一高峰.     

胰岛素的体外折叠: 折叠中间体的鉴定 及其折叠途径

在单链胰岛素体外折叠研究的基础上, 研究了胰岛素的体外折叠过程. 在胰岛素的折叠过程中捕捉到6个主要的折叠中间体, 分别命名为P1A, P2B, P3A, P4B, P5B和P6B. 中间体的折叠实验证明6个中间体都能最终折叠成胰岛素. 在中间体的鉴定和分析以及推断的过渡态中间体形成和作用的基础上, 提出了胰岛素体外折叠的两步折叠途径. (ⅰ) 在折叠过程的早期, 完全还原的胰岛素, 即A链和B链各自形成中间体: 2个A链中间体(P1A和P3A), 4个B链中间体(P2B, P4B, P5B和P6B). (ⅱ) 在进一步的折叠过程中, 推断相继产生3个过渡态中间体: 首先, 中间体P3A通过分子内巯基/二硫键交换反应形成过渡态中间体Ⅰ, 该中间体含有1个天然二硫键A6-A11和2个巯基分别位于A7和A20; 然后, 过渡态中间体Ⅰ的巯基和P4B或P6B上的巯基通过氧化反应(主要以折叠体系中的GSSG为氧化剂)分别形成含有2个天然二硫键的过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ; 最后, 过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ通过分子内巯基/二硫键交换反应形成第3个天然二硫键, 完成胰岛素体外折叠.     

胰岛素的体外折叠: 折叠中间体的鉴定 及其折叠途径

在单链胰岛素体外折叠研究的基础上, 研究了胰岛素的体外折叠过程. 在胰岛素的折叠过程中捕捉到6个主要的折叠中间体, 分别命名为P1A, P2B, P3A, P4B, P5B和P6B. 中间体的折叠实验证明6个中间体都能最终折叠成胰岛素. 在中间体的鉴定和分析以及推断的过渡态中间体形成和作用的基础上, 提出了胰岛素体外折叠的两步折叠途径. (ⅰ) 在折叠过程的早期, 完全还原的胰岛素, 即A链和B链各自形成中间体: 2个A链中间体(P1A和P3A), 4个B链中间体(P2B, P4B, P5B和P6B). (ⅱ) 在进一步的折叠过程中, 推断相继产生3个过渡态中间体: 首先, 中间体P3A通过分子内巯基/二硫键交换反应形成过渡态中间体Ⅰ, 该中间体含有1个天然二硫键A6-A11和2个巯基分别位于A7和A20; 然后, 过渡态中间体Ⅰ的巯基和P4B或P6B上的巯基通过氧化反应(主要以折叠体系中的GSSG为氧化剂)分别形成含有2个天然二硫键的过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ; 最后, 过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ通过分子内巯基/二硫键交换反应形成第3个天然二硫键, 完成胰岛素体外折叠.     

人胰岛素A、B链基因的合成、克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据人胰岛素A、B链的多肽顺序,设计并用一种简便快速的多肽基因合成了A、B链基因。合成的A 链和B 链基因分别克隆到pWR590质粒上,构建了表达型质粒pWR590-HIA和pWR 590-HIB,它们能够表达由β-半乳糖苷酶N-端约590个氨基酸残基与A 链或B 链组成的融合蛋白(两者之间由Met 连接)。A 链或B 链融合蛋白经BrCN 降解,磺化及分离纯化等步骤,得到了磺化A、B 链。磺化A、B链体外重组得到人胰岛素。     

猪胸腺激素T_1和E_1的纯化和性质

本文首次提出了从猪胸腺中获得两种胸腺激素纯品的方法。这两种激素分别命名为胸腺激素T_1和E_1。T_1和E_1为两种酸性蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检查,证明为均一的蛋白质,它不含糖或核苷酸类物质,经SDS凝胶电泳测定分子量分别为13000和68000,等电点分别为pH4.6和5.2。氨基酸初步分析的结果指出,两种蛋白质中酸性氨基酸的含量达1/4以上,芳香族氨基酸的含量则只有5%左右。根据以上结果判断,胸腺激素T_1和E_1显然不同于任何一种已报道的牛胸腺激素。T_1和E_1均有很强的生物学活性,可以促使不成熟的淋巴细胞分化为成熟的具有免疫功能的T淋巴细胞。     

猪胸腺激素T_1和E_1的纯化和性质

本文首次提出了从猪胸腺中获得两种胸腺激素纯品的方法。这两种激素分别命名为胸腺激素T_1和E_1。T_1和E_1为两种酸性蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检查,证明为均一的蛋白质,它不含糖或核苷酸类物质,经SDS 凝胶电泳测定分子量分别为13000和68000,等电点分别为pH4.6和5.2。氨基酸初步分析的结果指出,两种蛋白质中酸性氨基酸的含量达1/4以上,芳香族氨基酸的含量则只有5%左右。根据以上结果判断,胸腺激素T_1和E_1显然不同于任何一种已报道的牛胸腺激素。T_1和E_1均有很强的生物学活性,可以促使不成熟的淋巴细胞分化为成熟的具有免疫功能的T 淋巴细胞。     

分子进化淺释

如果对生物的某些大分子作一番解剖和比较,我们将会获得一系列十分新鲜的知识。拿胰岛素来说,这是比较了解的一种分子。现在有关马、牛、羊、猪以及鲸鱼胰岛素的氨基酸排列顺序,都已经全部弄清楚了。这种分子有51个氨基酸残基,分居二条链——A链(21个)和B链(30个)上(参见80年第二期第11页图1——编者)。对所研究的几种动物来说,胰岛     

脑及前胸腺对蓖麻蚕化蛹的作用

前言 昆虫内分泌中心的存在,已为科学工作者所承认。前胸腺激素控制昆虫的蜕皮,已在鳞翅目、半翅目和直翅目等目中证实。近年来,对昆虫脑激素作用的重要性,尤其是它在内分泌系统中所起的主导作用,已逐渐明确。 Kope(1922)除去舞毒蛾(Lymantria)末龄第2天幼虫的脑,幼虫不能化蛹;如在末龄10天后去脑,则对化蛹并无影响。Kope认为脑是控制化蛹的中心。一些作者在其它鳞翅目昆虫中也获得同样的结果。 后来福田(1940)在家蚕中发现前胸腺对化蛹起重要的作用,并认为前胸腺分泌的激素对化蛹起控制作用。     

保幼激素合成的研究进展

保幼激素 (juvenile hormone,JH) 是通过甲羟戊酸途径合成的一类倍半萜化合物。以昆虫中普遍存在的JH Ⅲ为例,从分子水平上概述了JH合成途径中的各种酶,并对其中的两个关键酶：羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和保幼激素酸甲基转移酶作了详细介绍。还从家蚕基因组数据库(http://silkworm.genomics.org.cn)中推测出了JH合成途径中大部分酶的编码基因,初探了JH合成的调节机制,讨论了JH合成的研究趋势。