依他尼酸抑制小鼠气管平滑肌收缩北大核心CSCD

本研究旨在探讨依他尼酸(ethacrynic acid, EA)抑制气管平滑肌(airway smooth muscle, ASM)收缩的作用及其机制。利用BL-420S系统测量小鼠气管环张力,用全细胞膜片钳技术记录ASM细胞通道电流,用钙成像系统测量ASM细胞内Ca^2+浓度。结果显示,EA剂量依赖性地抑制高-K^+(80 mmol/L)和乙酰胆碱(acetylcholine, ACh, 100μmol/L)引起的小鼠气管环收缩,最大舒张百分比分别为(97.02±1.56)%和(85.21±0.03)%,半数有效浓度(median effective concentration, EC50)分别为(40.28±2.20)μmol/L和(56.22±7.62)μmol/L。EA分别降低高-K^+和ACh诱导的细胞内Ca^2+浓度,分别从0.40±0.04降到0.16±0.01,0.50±0.01降到0.39±0.01。此外,EA抑制ASM细胞L-型电压依赖钙通道(L-type voltage-dependent calcium channel,LVDCC)和钙库操纵的钙离子通道(store-operated calcium channel, SOCC)电流,以及高-K^+和ACh引起的外Ca^2+内流。同时,EA可以降低小鼠呼吸系统阻力(resistance of the respiratory system, Rrs)。以上结果提示,EA通过抑制小鼠ASM细胞LVDCC和SOCC,抑制Ca^2+的内流,降低细胞内Ca^2+浓度,导致ASM舒张,提示EA是一种潜在的支气管扩张剂。     

愈伤组织形成过程中钙离子与激素诱导效应的关系

实验研究了在胡萝卜、烟草愈伤组织形成过程中,激素诱导作用与钙离子的关系。结果表明:在含有正常浓度的激素和Ca~(2+)的培养基中,0.1—1mmol/L Ca~(2+)螯合剂EGTA抑制愈伤组织鲜重增长78.0%—88.4%; 10—50μmol/L尼群地平及10—60μmol/L异博定等细胞膜钙通道阻断剂分别抑制愈伤组织鲜重增长19.1%—81.9%及17.6%—70.3%。除去上述Ca~(2+)螯合剂及Ca~(2+)通道阻断剂后,受抑制的外植体基本上可恢复生长。在无激素培养基中,10—30μmol/L Ca~(2+)载体A_(23187)可使外植体膨大,使外植体脱分化细胞增多,并出现分生细胞团,初步说明A_(23187)诱导的Ca~(2+)内流可以部分地模拟激素的作用。以膜显示剂氯四环素探测胞内Ca~(2+)分布时发现分裂细胞、脱分化细胞、分生细胞团及愈伤组织区域的细胞荧光较强。以上事实说明在愈伤组织形成中激素诱导效应与细胞内Ca~(2+)有密切关系。     

血管紧张素Ⅱ增加新生鼠脑细胞胞浆Ca~(2+)浓度

本文应用荧光钙测定技术观察了血管紧张素Ⅱ(AⅡ)对新生Wistar鼠脑细胞胞浆Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)的影响。结果表明:血管紧张素Ⅱ在1nmol/L—1μmol/L浓度下可诱导新生鼠脑细胞[Ca~(2+)]_i增加,具量效关系。在无外Ca~(2+)存在对,其增加幅度有所减少。上述效应可被血管紧张素Ⅱ拮抗剂Saralasin所阻断,并呈剂量依赖关系。上述结果提示,血管紧张素Ⅱ可激活血管紧张素AⅡ受体,增加脑细胞[Ca~(2+)]_i,该效应通过细胞内Ca~(2+)释放和细胞外Ca~(2+)内流两条适径实现,前者的作用是主要的。     

烟碱对脑细胞内钙离子浓度的调控及其机制分析

神经肌肉接头及神经节N受体均可引起细胞外Ca~(2 )内流和细胞内Ca~(2 )释放,增加细胞内Ca~(2 )浓度。尚无资料证明脑N受体是否影响细胞内Ca~(2-)浓度。本实验观察烟碱对脑细胞内Ca~(2 )浓度的影响并探讨其可能的机理。 烟碱对大鼠脑突触体主动摄取~(45)Ca~(2 )的影响 本实验条件下钙通道激动剂Bay-k-8644(10~(-7)～10~(-4)～mol/L)浓度依赖性地增加突触体~(45)Ca~(2 )主动摄取量;钙通道拮抗剂异搏定(10~(-9)～10~(-5)mol/L)浓度依赖性地抑制~(45)Ca~(2 )摄取     

重金属离子对猪红细胞膜Ca~(2+)-ATP酶的作用

猪红细胞膜Ca~(2+)-ATP酶是一种钙调蛋白(CaM)依赖酶,其活力又依赖巯基的完整性。实验应用Ca~(2+)-ATP酶这一模型体系观察到重金属离子,Pb~(2+)、Cd~(2+)和Hg~(2+)都能替代Ca~(2+),激活CaM,从而激活Ca~(2+)-ATP酶;其最大刺激活力分别为85％、80％和30％,半刺激浓度分别为32、27和0.7μmol/L。当三种重金属离子的浓度增加时,则与Ca~(2+)-ATP酶的巯基结合,抑制酶的活力,Pb2~(2+)、Cd~(2+)和Hg~(2+)的半抑制浓度分别为370、440和2μmol/L。抑制作用为渐进性过程,而刺激作用为即时效应。抑制作用可为巯基化物,特别是二巯基化物所逆转。研究结果提示,CaM可能是重金属中毒最初作用的靶分子,而重金属中毒不仅使CaM“开关”失灵,还可能导致细胞内Ca~(2+)的调节全面失控。     

内向整流钾通道阻滞剂BaCl_2引起大鼠冠状动脉收缩的机制

为了探讨内向整流钾通道(inward rectifier K~+channels,K_(ir))阻滞剂BaCl_2引起大鼠冠状动脉(rat coronary artery,RCA)收缩的作用机制,本研究采用离体微血管环张力记录法观察BaCl_2引起的RCA收缩对细胞内Ca~(2+)([Ca~(2+)]_i)释放和细胞外Ca~(2+)([Ca~(2+)]_o)内流的依赖性,并通过抑制剂实验探讨其作用机制。结果显示,静息状态下,BaCl_2(0.1~1.0 mmol/L)浓度依赖性地收缩离体RCA,最大收缩幅度为(5.69±1.07)m N,与KCl(60 mmol/L)收缩幅度相近;BaCl_2在无钙液中所引起的收缩占其总收缩的(35.44±6.72)%,复钙进一步引起(64.56±5.94)%的收缩;钙通道阻滞剂硝苯地平(0.3μmol/L)、环氧合酶抑制剂吲哚美辛(100μmol/L)、细胞外信号调节激酶ERK1/2抑制剂PD98059(10μmol/L)和氯通道阻滞剂尼氟灭酸(100μmol/L)分别使BaCl_2引起的RCA最大收缩幅度降低(87.82±5.43)%(P0.01)、(73.23±5.47)%(P0.01)、(75.69±7.94)%(P0.01)和(83.24±7.69)%(P0.01)。上述实验结果表明,BaCl_2引起RCA收缩依赖于[Ca~(2+)]_i释放和[Ca~(2+)]_o内流,并提示该过程与增加前列腺素类物质合成、钙通道和氯通道激活及ERK1/2通路有关。     

缰核内注射Ca^2＋拮抗电针镇痛的作用可被三碘季铵酚翻转

通过埋植套管向大鼠双侧缰核分别注射0.1mol/L CaCl_2 0.5μl,0.06mol/L ACh0.5μl,5.4×10~(-3)mol/L三碘季铵酚0.5μl和14.4×10~(-3)mol/L阿托品0.5μl后观察到,Ca~(2 )降低基础痛阈并拮抗电针镇痛效应;ACh拮抗电针镇痛;Ca~(2 )拮抗电针镇痛的作用可被胆碱能N受体阻断剂三碘季铵酚完全翻转。提示缰核内的Ca~(2 )可能通过ACh实现其拮抗电针镇痛的效应。     

芍药苷对大鼠背根神经元细胞内Ca~(2+)的影响

目的建立一种评价芍药苷对大鼠背根神经节神经元细胞内游离Ca~(2+)浓度影响的方法。方法显微解剖获取大鼠背根神经节(DRG),通过胰蛋白酶消化,过筛,用DF-12和抗有丝分裂培养液交替培养纯化,获得原代大鼠DRG神经元细胞,并采用细胞免疫荧光技术测定DRG神经元细胞纯度;采用激光共聚焦显微成像技术,观察细胞内Ca~(2+)荧光强度的变化,并对Ca~(2+)荧光强度变化率进行分析,探讨芍药苷对DRG细胞内游离钙离子浓度及辣椒素受体的影响。结果采用上述方法分离得到的DRG细胞纯度可高达95%以上,辣椒平可通过阻断辣椒素激活的瞬时受体电位通道的作用而抑制细胞内Ca~(2+)的增加。芍药苷表现出与辣椒平类似的作用,可以阻断细胞外Ca~(2+)内流。结论芍药苷可能是通过作用于TRPV1通道,而抑制DRG细胞内Ca~(2+)大量增加,本方法可以用于评价药物对大鼠DRG细胞内Ca~(2+)浓度的影响。     

TRPC1与Orai1的相互作用参与人脐静脉内皮细胞钙敏感受体介导的钙内流及一氧化氮生成

本研究旨在探讨Ca~(2+)感受蛋白经典瞬时感受器电位蛋白1(canonical transient receptor potential channel 1,TRPC1)与钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release-activated calcium modulator 1,Orai1)的相互作用在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)钙敏感受体(Ca-sensing receptor,Ca R)介导的Ca~(2+)内流和一氧化氮(NO)生成中的作用。取2~3代HUVECs,单独或联合用Ca R激动剂精胺[Spermine,激活钙库活化的钙通道(store-operated calcium channels,SOC)和受体活化的钙通道(receptor-operated calcium channels,ROC)]、ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)+Ca R负性变构调节剂Calhex231(阻断SOC,激活ROC)、PKC抑制剂Ro31-8220(激活SOC,阻断ROC)以及经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967(激活SOC,阻断ROC)处理。用免疫荧光技术检测HUVECs中TRPC1和Orai1的蛋白表达、共定位;用免疫共沉淀法检测TRPC1和Orai1之间的相互作用模式;随后用TRPC1和Orai1干扰质粒联合转染HUVECs,采用荧光探针同时检测HUVECs中[Ca~(2+)]i和NO生成的变化。结果显示,HUVECs中TRPC1和Orai1蛋白表达共定位于胞膜。与Spermine+Ca~(2+)组相比,Calhex231+TPA+Spermine+Ca~(2+)组、Ro31-8220+Spermine+Ca~(2+)组和Go6976+Spermine+Ca~(2+)组HUVECs中定位于胞浆中的TRPC1、Orai1蛋白表达均显著降低,二者的结合也减少。免疫共沉淀结果显示,Calhex231+TPA+Spermine+Ca~(2+)组、Ro31-8220+Spermine+Ca~(2+)组和Go6976+Spermine+Ca~(2+)组TRPC1/Orai1和Orai1/TRPC1相对比值百分数均明显低于对照组以及Spermine+Ca~(2+)组(均P0.05),表明Orai1和TRPC1相互作用均减弱。联合转染质粒敲低TRPC1和Orai1显著降低Spermine+Ca~(2+)组、Calhex231+TPA+Spermine+Ca~(2+)组、Ro31-8220+Spermine+Ca~(2+)组和Go6976+Spermine+Ca~(2+)组的HUVECs中[Ca~(2+)]i和NO生成。以上结果提示,TRPC1与Orai1以二元复合物的形式激活SOC和ROC,介导Ca~(2+)内流及NO生成。     

钙离子与激素对小麦黄化幼苗离体核转录活性的影响

400μmol/LKT加于离体核反应液中后,核转录活性提高了50％左右;参入系统中加入5μmol/LCa~(2+),使核转录活性提高了90％,Ca~(2+)浓度大于500μmol/L时,产生负效应。La~(3+)及EGTA明显地消除Ca~(2+)的促进作用。钙调蛋白抑制剂酚噻嗪部分地减弱Ca~(2+)的促进作用;用酚噻嗪和KT同时处理离体核,则KT的促进作用大大削弱。     

ACh对人垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C、胞内游离钙及cAMP/cGMP的影响

我们曾发现ACh可明显地抑制垂体腺瘤细胞的增殖代谢,为深入探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖作用的机制,观察了ACh作用后垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C(PKC)、[Ca^2 ]i及cAMP／cGMP的变化。结果发现：(1)与空白处理组相比,使用PKC的激动剂PMA处理培养的人垂体腺瘤细胞时可使胞浆、胞膜和细胞总PKC活性浓度均升高,但ACh(10μmol/L)作用15min后,胞浆、胞膜和细胞总PKC活性均下降,且此作用可被阿托品阻断;(2)ACh(10μmol/L)作用于单个人垂体腺瘤细胞后,立即使垂体腺瘤细胞[Ca^2 ]i相对水平降低,但此作用可被阿托品阻断;(3)ACh作用于人垂体腺瘤细胞15min后,胞内cAMP水平均明显升高,而cGMP没有改变。该结果为探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖的分子机制提供了重要线索,同时提示,ACh对垂体瘤细胞增殖分化的调控作用是细胞内多信息系统相互整合的结果。     

非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流

脑内β-淀粉样蛋白(amyloid-βprotein,Aβ)的聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的重要病理特征。Aβ的神经毒性作用机制与其扰乱神经元Ca~(2+)稳态有密切关系。非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)是近年发展起来的一种利用Fick第一扩散定律和Nernst方程,通过非接触方式检测膜外扩散电位获取离子跨膜流速的最新技术手段。本研究在C57BL/6小鼠海马脑片,利用NMT首次检测了Aβ对谷氨酸(Glu)诱发的Ca~(2+)内流以及细胞外低钙引起的Ca~(2+)外排的影响,并初步探讨了Aβ扰乱神经元Ca~(2+)稳态的相关机制。结果显示:(1)急性给予Glu可诱发海马脑片CA1区神经元产生起始快、继而缓慢衰减的持续性内向Ca~(2+)流;(2)Aβ预处理浓度依赖性地增强海马神经元对Glu的反应性,显著提高给药后5 min内Ca~(2+)内流的平均流速,而NMDA受体拮抗剂D-APV可有效阻断Aβ对神经元Glu反应的这种易化作用;(3)用低钙人工脑脊液急性灌流脑片可引起海马CA1区神经元产生持续的外向跨膜Ca~(2+)流,其大部分可被特异性Na+/Ca~(2+)交换体抑制剂KB-R7943所阻断;(4)Aβ预处理可部分抑制低钙人工脑脊液引起的Ca~(2+)外排。这些结果表明:Aβ引起的细胞内Ca~(2+)超载不仅涉及到Ca~(2+)内流增加,也与其对Ca~(2+)外排的抑制有关;Aβ易化Glu的兴奋毒作用主要是通过NMDA受体介导的,其抑制Ca~(2+)外排的靶点主要是Na+/Ca~(2+)交换体。NMT具有操作相对简单、实时获取结果、非损伤的优点,适用于脑片Ca~(2+)内流和Ca~(2+)外排的长时间测定。因此,本研究不仅为解释Aβ所致Ca~(2+)超载的神经毒性机制提供了新的实验证据,也为开展跨膜Ca~(2+)信号转导机制的脑研究提供了新的技术方法。     

钙离子通道亚基Cacnb3对小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

间充质干细胞在治疗骨相关疾病中具有重要意义,但其在成骨分化中的机制尚未完全阐明。该研究通过分析GEO数据库中有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)处理过的小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)的生物芯片数据,筛选出22个在成骨分化中上调,在成脂分化中下调,且受HDACi紧密调控的基因。这22个基因中有6个基因(Cacnb3、Lpcat2、Cd248等)与Ca~(2+)调节功能相关,提示Ca~(2+)可能在MSCs分化中发挥重要作用。在后续实验中,我们观察到电压依赖性钙通道亚单位β3(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit beta 3, Cacnb3)和磷脂酰基转移酶2(lysophosphatidylcholine acyltransferase 2, Lpcat2)在小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)、人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)的成骨分化过程中上调,提示Cacnb3、Lpcat2可能参与ADSCs的体外成骨分化。此外,利用钙离子荧光探针检测方法,发现敲低Cacnb3后3T3-E1细胞内Ca~(2+)浓度明显低于对照组,同时,成骨相关基因(ALP、Runx2)表达显著下调,表明Cacnb3可能通过影响Ca~(2+)浓度调控细胞的成骨分化,该研究为进一步探索间充质干细胞成骨分化的机制奠定了基础。     

马兜铃酸与钙调素相互作用的荧光光谱分析——一种非钙离子依赖性钙调素拮抗剂的研究

本文报道我室近来发现的一种天然钙调素(Calmodulin,CaM)拮抗剂马兜铃酸(Aristolochic acid,ATA)的研究。利用丹磺酰标记的CaM(D-CaM)对马兜铃酸的研究表明,马兜铃酸是一种非钙离子依赖性钙调素拮抗剂,实验测得马兜铃酸与D-CaM结合的解离常数,有Ca~(2+)和无Ca~(2+)情况下分别为70μmol/L、77μmol/L。两种状况下马兜铃酸对D-CaM荧光强度的抑制分别为40％、41％。暗示马兜铃酸主要作用于CaM上Ca~(2+)诱导的疏水区之外。三氟啦嗪(TFP)引起的D-CaM荧光增强可被马兜铃酸明显降低,而TFP在达到马兜铃酸浓度的15倍以上仍未能逆转马兜铃酸对D-CaM荧光强度的降低作用,这为马兜铃酸主要作用于CaM上Ca~(2+)诱导的疏水区以外提供了又一佐证。     

二氧化碳和臭氧浓度升高对四季竹矿质养分含量和运输的影响

为阐明CO_2和O_3浓度升高对竹子矿质养分含量和运输的影响,以2年生四季竹(Oligostachyum lubricum)为试材,采用开顶式气室(OTCs)设置了环境背景大气[CK,(40±5)nmol·mol~(-1) O_3,(360±20)μmol·mol~(-1) CO_2]、O_3浓度升高[EO,(100±10)nmol·mol~(-1) O_3,(360±20)μmol·mol~(-1) CO_2]、CO_2浓度升高[EC,(40±5)nmol·mol~(-1) O_3,(700±35)μmol·mol~(-1) CO_2]、CO_2和O_3浓度复合升高[EOEC,(100±10)nmol·mol~(-1) O_3,(700±35)μmol·mol~(-1) CO_2]4个处理,测定了竹叶、竹枝、竹秆和竹根的Na+、Fe(~(2+,3+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)含量,并分析了矿质营养在器官间的转运情况。结果显示:与CK比较,EO处理显著降低了四季竹植株体内Na+和Fe(~(2+,3+)含量,特别是竹根和竹叶,同时也明显降低Na+和Fe(~(2+,3+)器官间的运输能力。EC处理显著降低了四季竹植株体内Na+含量,而未改变其他矿质元素含量,但其器官中的分配格局和运输能力发生变化,尤其是竹枝向竹叶运输Ca~(2+)和Mg~(2+)的能力增强。EOEC处理显著降低了四季竹植株体内Na+含量,但显著提高了Fe(~(2+,3+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)含量及其向上运输能力。研究表明,O_3浓度升高降低了四季竹植株体内矿质养分含量和器官间养分运输能力,在一定程度上影响四季竹的正常生长;CO_2浓度升高通过提高Ca~(2+)和Mg~(2+)向光合器官叶片的运输能力,促进四季竹生长;CO_2和O_3浓度升高复合作用能够通过提高四季竹光合器官竹叶中Fe(~(2+,3+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)含量及其向光合器官叶片的运输能力,以维持体内矿质养分元素的平衡,提高四季竹对高浓度CO_2和O_3浓度复合环境下的适应能力。     

粉防已碱与红细胞膜ATPase相互作用的研究

粉防已碱是一种新的钙调蛋白拮抗剂,专一性抑制人红细胞膜上依赖CaM的Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase。在较高浓度下,它也不同程度地抑制Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase基本活性、Na~+-K~+-ATPase和Mg~(2+)-ATPase的活性。 除CaM外,不饱和脂肪酸和有限水解均导致膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase的活化,所有这些活化作用被Tet在大约相同的浓度范围内抑制,表明Tet除与CaM结合外,也与膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase结合。 Tet具有抗抵渗溶血的性能,反映了拮抗CaM与药物的膜稳定性间存在相关性。     

钙离子对细菌内毒素含量测定的影响

目的研究Ca~(2+)对细菌内毒素含量检测的影响,探讨其影响机制。方法向已知含量的细菌内毒素溶液中加入不同浓度的Ca~(2+),用动态浊度法检测各样品中细菌内毒素含量。对检测结果进行离散系数,即CV值分析,确定干扰限值。对加入不同浓度Ca~(2+)的细菌内毒素进行核磁共振1H谱研究。结果当Ca~(2+)浓度高于0.002 0 mol/L时,检测结果的CV值较高; Ca~(2+)浓度越高,CV值越高,离散程度越大;当Ca~(2+)浓度达到1 mol/L时,检测结果低于检测限,呈现明显的假阴性。1H谱研究发现,随着Ca~(2+)浓度的增高,处于低场的氢的化学位移向高场移动,Ca~(2+)浓度越高,移动越大。结论为获得准确的检测结果,当Ca~(2+)浓度高于0.002 0 mol/L时,应先消除干扰,再测定细菌内毒素含量。Ca~(2+)可能通过影响细菌内毒素的空间构象来影响其与鲎试剂的反应。     

大鼠心肌线粒体Ca2+-ATP酶的制备及活性测定

Ca~(2 )在细胞内有许多重要的功能,它参与不同酶系和多种类型细胞活动的调节。细胞内Ca~(2 )的这些功能需很低的Ca~(2 )浓度(μmol/L或更低),维持细胞浆低Ca~(2 )浓度是与细胞Ca~(2 )调节装置有关,心肌细胞的这类装置包括肌膜、肌浆网、线粒体以及一些与Ca~(2 )结合的蛋白(如钙调素)和小分子物质,其中线粒体是重要的机构之一。Vasington等首次报道了肾脏线粒体对Ca~(2 )的摄取作用,并注意到这一过     

平面双分子层脂质膜上人工重建大电导钙激活钾通道

本研究旨在探索建立一种稳定平面双分子层脂质膜(planar lipid bilayer membranes,PLBMs)的制备方法,并尝试将大电导钙激活钾通道(large conductance calcium-activated potassium channel,BK_(Ca))蛋白融合其上进行单通道电流研究。将卵磷脂与胆固醇氯仿按3:1比例混合,用N_2吹干氯仿,制成癸烷脂质液,采用涂抹法制备PLBMs,并将BK_(Ca)重建到PLBMs上,用膜片钳研究其单通道特性。结果显示,重建到PLBMs上的BK_(Ca)的单通道的电导值为(206.8±16.9)pS,当浴液中[Ca~(2+)]=0μmol/L时,无论超极化或去极化状态下均很少见到BK_(Ca)的通道活动。膜电位为+40 m V时,当[Ca~(2+)]由1μmol/L增加到100μmol/L时,通道开放概率由0.034±0.002增加到0.961±0.013,平均开放时间由(1.1±0.2)ms延长到(151.3±10.2)ms,平均关闭时间由(32.2±2.8)ms缩短为(2.1±1.8)ms;当K+浓度为40/140 mmol/L(Cis/Trans)时,重建的BK_(Ca)反转电位在-30 mV左右。以上结果提示:(1)涂抹法可用于PLBMs的制备;(2)重建后的BK_(Ca)通道具有电导值大、电压依赖性、Ca~(2+)敏感性和K~+选择性;(3)PLBMs技术可用于BK_(Ca)通道的药理学和动力学特性的研究。     

喜树碱诱导甜菜夜蛾细胞凋亡线粒体途径的MPTP依赖性

【目的】线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放可以导致线粒体膜通透性改变,与细胞凋亡关系密切。本研究旨在探索MPTP在喜树碱诱导的昆虫细胞凋亡中的作用,以进一步揭示喜树碱(CPT)诱导昆虫细胞凋亡的机制。【方法】环孢菌素A(CsA)为MPTP开放抑制剂,通过预加入20μmol/L CsA,应用流式细胞仪测定其对CPT和羟基喜树碱(HCPT)诱导的甜菜夜蛾Spodoptera exigua细胞(IOZCAS-SPEX-Ⅱ)凋亡作用的影响,包括细胞内Ca~(2+)浓度变化,线粒体膜电位变化以及活性氧簇(ROS)变化,从而分析MPTP在CPT和HCPT诱导细胞凋亡的作用。【结果】结果显示,10μmol/LCPT和HCPT处理IOZCAS-SPEX-Ⅱ细胞6 h和12 h时,与0.1%DMSO对照组相比,甜菜夜蛾细胞发生凋亡,胞质Ca~(2+)浓度增大,线粒体膜电位降低或丧失,ROS增加,即CPT和HCPT诱导甜菜夜蛾细胞发生凋亡,为线粒体内途径。但经过20μmol/L CsA预处理2 h后再加入CPT和HCPT处理6 h,与0.1%DMSO组相比,细胞凋亡率、胞质Ca~(2+)浓度、线粒体膜电位及ROS产生均无显著差异(P0.05),即CsA抑制了MPTP的开放,从而抑制了CPT和HCPT诱导的甜菜夜蛾细胞凋亡;而加入CPT和HCPT处理12 h时,CsA对MPTP开放的抑制作用显著降低,与单CPT和HCPT处理组相比,细胞凋亡率、胞质Ca~(2+)浓度、线粒体膜电位及ROS差异不显著,即CPT和HCPT诱导的细胞凋亡如常发生。【结论】本研究证实喜树碱和羟基喜树碱诱导甜菜夜蛾细胞凋亡线粒体途径具有MPTP开放依赖性,且首次明确这种依赖性具有时间性。