人黑色素瘤相关抗原Restin的克隆和表达

目的:通过对原核表达载体、表达条件和宿主菌的优化,利用原核表达系统有效表达可溶性的人Restin融合蛋白.方法:应用PCR方法扩增获得Restin编码区,克隆入原核表达载体pET44a(+),分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3),不同的IPTG浓度诱导表达Restin重组融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物.结果:成功构建了重组载体pET44a(+)-Restin,并在E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3)中获得了可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的8.9%.结论:可溶性Restin融合蛋白的获得为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础.     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionineβ-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS)。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19 mg/L培养物),并测得其比活力约为57 kU/g。结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达及其对大肠杆菌低温耐受性的增强作用

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, GST, EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶, 为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)中的具体地位, 采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析; 并构建了原核表达载体pET28a(+)-GST, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达, 通过平板培养法探讨了重组菌E. coli BL21(pET28a(+)-GST)对低温胁迫的耐受性。结果显示, GST在0℃时表达量最高, 最高可达对照组的两倍多; pET28a(+)-GST重组表达载体在E. coli BL21中实现了高效表达, 且主要以包涵体形式存在, 经HisTrap HP柱分离纯化获得高纯度的GST融合蛋白, 并通过SDS-PAGE及Western blot分析得以验证; 对低温胁迫实验发现南极衣藻GST蛋白的表达可以提高重组菌E. coli BL21对低温的耐受性, 说明GST基因对南极衣藻适应南极低温环境具有重要作用。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。     

牛分枝杆菌 MPB63基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌 Vallee111 染色体 DNA 为模板,以 MPB63 成熟蛋白基因特异性引物进行 PCR 扩增,获得约 400 bp 的 DNA 片段 . 通过 T-A 克隆技术,将 PCR 产物克隆至 pGEM-T Vector 中,成功地构建出克隆载体 pGEM-T-63. 以 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切 pGEM-T-63 和 pET28a(+) ,并将纯化的 MPB63 基因亚克隆至 pET28a (+) 中,构建出原核表达载体 pET28a-63. 将 pET28a-63 转化至感受态 E.coli BL21(DE3) 中,经 IPTG 诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可见约 18 ku 外源蛋白带 . 蛋白质印迹分析发现,该蛋白质具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究 MPB63 的亚单位疫苗及 DNA 疫苗奠定基础 .     

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

东亚三角涡虫PSA蛋白的表达、鉴定及抑菌分析

PCR扩增含酶切位点的DjPsa基因(ORF),构建了DjPsa基因的原核表达载体pET-28a(+)-DjPsa,转化入Ecoli BL21(DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting(His-Tag抗体)分析表达蛋白,抑菌试验检测其活性.结果表明,重组质粒在E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,其蛋白的分子大小约为25 kD;Western blotting检测说明得到的蛋白为PSA重组蛋白:抑菌试验显示复性后的PSA具有较强的抑菌作用,为进一步研究它的功能、活性提供基础.     

狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的原核表达及鉴定

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV) 核衣壳(N)蛋白基因抗原性好的高保守基因片段,将其TA克隆至pMD18-T载体中,再利用酶切、连接的方法将测序正确的N基因目的片段亚克隆到原核表达载体pET24b中6×His Tag编码基因的上游,并将该重组质粒转化大肠杆菌Rosetta 2 (DE3)株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE 分析和Western blot 分析的结果显示,表达产物的分子质量为15 kD,与CDV标准阳性血清呈阳性反应,间接ELISA结果也表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效区分CDV标准阳性与阴性血清,表明大肠杆菌表达的CDV N 蛋白在免疫原性上具有与天然N蛋白同样的特性,可作为检测CDV的间接ELISA包被抗原。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB51成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。通过TA克隆技术,将PCR产物克隆至pGEMT Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEMT51。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEMT51和pET28a(+),并将纯化的MPB51基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达质粒pET28a51。将pET28a51转化至感受态E.coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDSPAGE分析,可见约30kD外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB51的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a（＋）内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1：2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a（＋）-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pET32a原核表达载体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定。方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别。结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达。     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。