小鼠RMND5A的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

RMNDSA通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.通过PCR扩增RMND5A基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过IPTG进行诱导表达GST-RMND5A融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot检测抗体活性.结果说明,获得了RMND5A原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗RMND5A多克隆抗体,为RMND5A进一步的功能研究奠定了基础.     

MEK5基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEK5的表达抑制

目的 构建人MEK5基因的小干扰RNA（siRNA）重组腺病毒表达载体,观察其在胃腺癌SGC7901细胞中对MEK5的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEK5基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,将得到的重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后在大肠埃希菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组.将PacⅠ酶切鉴定正确的重组腺病毒质粒经乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEK5-siRNA重组腺病毒.病毒体外转导人胃腺癌SGC7901细胞,Western印迹法检测其对MEK5表达的抑制.结果 经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEK5-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western印迹检测结果显示pAd-MEK5-siRNA2可抑制MEK5基因的表达,其有效抑制率达75.5 %.结论本研究成功地构建了针对人MEK5基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEK5基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础.     

小鼠 LRRC 10腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

目的：构建含有小鼠Lrrc10（Leucine-rich Repeat Containing protein 10）基因的重组腺病毒表达载体。方法：设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和Sal Ι酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18 T载体。测序后,用Sal Ι和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到 pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察 GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果：用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论：小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。     

含CD自杀基因腺病毒载体的构建及其应用

构建了含ＣＭＶ启动子、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ｃｄ）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶＣＤ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定证实,ｃｄ基因已克隆进入ＡｄＣＭＶＣＤ,并在受染细胞中表达。经氯化铯密度梯度离心法纯化的病毒滴度达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。经１００ｍ．ｏ．ｉ．的ＡｄＣＭＶＣＤ感染的ＨｅＬａ和Ｃ６细胞株在１００μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,细胞存活率＜２０％。同时也观察到ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统有很强的旁杀伤效应,将３．３％的ＡｄＣＭＶＣＤ受染细胞与９６．７％的野生型细胞混合,经５０μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,＞６０％的细胞被杀死。ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

含人纤溶酶原K5基因的腺病毒载体制备和功能研究

应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA基因 ,与真核表达载体pcDNA3重组 ,形成重组质粒pcDNA3K5 ,与穿梭质粒pShuttle重组得pShuttleK5 ,经与腺病毒DNA重组 ,PCR鉴定正确 ,即为pAd K5。脂质体法将其转染 2 93细胞后 ,制备细胞裂解液 ;噬斑分析法测定病毒滴度为 5× 10 8pfu mL。将病毒以不同的感染系数 (MOI)感染人脐静脉内皮细胞株ECV30 4和人乳腺癌细胞株MDA MB 2 31,MTT法检测两者的增殖情况 :ECV30 4细胞增殖受抑制 ,而MDA MB 2 31细胞增殖未受明显影响。将感染病毒的ECV30 4细胞接种于ECMatrixTM胶 ,显示内皮细胞分化和毛细血管管腔形成受抑制。表明所构建的含人纤溶酶原K5基因的重组复制缺陷型腺病毒具有抑制ECV30 4细胞增殖、分化和管腔形成的作用而对MDA MB 2 31细胞的生长则无影响。     

利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆

为了构建人5型腺病毒(HAdV-5)的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架(包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI),在引物的5'端添加HAdV-5基因组末端序列(约30NT)和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用PacⅠ酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路。     

含人纤溶酶原K5基因的腺病毒载体制备和功能研究

应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因,与真核表达载体pcDNA3重组,形成重组质粒pcDNA3K5,与穿梭质粒pShuttle 重组得pShuttleK5,经与腺病毒DNA重组,PCR鉴定正确,即为pAdK5。脂质体法将其转染293细胞后,制备细胞裂解液;噬斑分析法测定病毒滴度为5×10⁸ pfu/mL。将病毒以不同的感染系数(MOI)感染人脐静脉内皮细胞株ECV304和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法检测两者的增殖情况：ECV304细胞增殖受抑制,而MDA-MB-231细胞增殖未受明显影响。将感染病毒的ECV304细胞接种于ECMatrix^TM胶,显示内皮细胞分化和毛细血管管腔形成受抑制。表明所构建的含人纤溶酶原K5基因的重组复制缺陷型腺病毒具有抑制ECV304细胞增殖、分化和管腔形成的作用而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

携带PTEN基因的重组腺病毒表达载体构建的研究

构建携带抑癌基因PTEN(Phosphatase and temin homolog deleted on chromosome ten)的重组腺病毒表达裁体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定基础.采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增目的基因PTEN,克隆人含绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein),GFP基因的pAdTrack-CMV穿梭质粒,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;获得重组腺病毒质粒,经Pacl线性化后,转染AD293细胞.结果表明,感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP基因,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因.成功构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定了基础.     

结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建能介导结缔组织生长因子（CTGF）基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法：以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad．H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果：构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU／mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论：构建的腺病毒载体Ad．H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。     

采用Gateway^TM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

目的：采用基于attLXattR的入噬茵体位点特异性重组系统的Gateway^TM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体（Ad—hBMP-2）。方法：从pcDNA3．1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中,形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad／CMV／V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad—BMP-2,经鉴定将ad—BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达。结果：经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的载体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×10^9pfu／ml,western blotting结果证实Ad—hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白。结论：本实验首次利用基于入噬菌体的位点特异性重组系统的Gateway^TM技术成功构建了Ad—hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础。     

采用GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

目的:采用基于attLXattR的λ噬菌体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒栽体(Ad-hBMP-2).方法:从pcDNA3.1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中.形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad-BMP-2,经鉴定将ad-BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达.结果:经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的栽体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×109pfu/ml.western blotting结果证实Ad-hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白.结论:本实验首次利用基于λ噬菌体的住点特异性重组系统的GatewayTM技术成功构建了Ad-hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础.     

小鼠CDC26基因短发夹RNA重组腺病毒载体的构建与表达分析

目的:构建靶向CDC26基因的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体,干扰小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中CDC26的表达。方法:设计小鼠靶向CDC26基因的shRNA,插入穿梭质粒pENTRY-EF1a-EGFP-Mir30,通过Gateway系统获得重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA;线性化后转染HEK293A细胞,进行病毒包装;用包装的重组腺病毒感染MEF,24 h后收集细胞,提取总RNA,逆转录后用荧光定量PCR法检测MEF内CDC26 mRNA的变化,以检测所设计shRNA的敲低效率。结果:构建的重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA经酶切鉴定后正确;转染HEK293A细胞后8 d,观察到细胞病变及GFP的大量表达,表明重组腺病毒包装成功;感染MEF后,实时荧光定量PCR检测表明,细胞内CDC26 mRNA的水平较对照组敲低了73.14%,腺病毒注射7 d后,注射CDC26 shRNA的小鼠血糖较对照组明显降低。结论:构建了具有较高敲低效果的小鼠CDC26基因shRNA重组腺病毒,并且具有体内活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入。获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株。纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSVGP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白。猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株。