出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H786-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株(缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp),并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

志贺毒素2型噬菌体ΦMin27的stx2基因突变株构建及其感染特性

[目的]通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性.[方法]利用九噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因(cat)插入到大肠杆菌O157:H7 Min27株的stx2基因中,获得O157:H7 Min27的突变菌株Min27(Astx::cat).用丝裂霉素对该突变菌株进行诱导,结合抗性标记和PCR方法筛选出一株突变的志贺毒素2型噬菌体,命名为ΦMin27(△stx::cat).采用双层琼脂平板法和氯霉素抗性筛选的方法,观察ΦMin27(△stx::cat)感染21株不同血清型大肠杆菌后的裂解和溶原转换情况.[结果]2株血清型分别为O 60和O 138的大肠杆菌可以被ΦMin27(△stx::cat)溶原感染,表现出对氯霉素的抗性,但没有形成噬菌斑,而大肠杆菌MG1655株既可以被溶原又可以被裂解.溶原的菌株经丝裂霉素诱导后,能释放出感染性的ΦMin27(△stx::cat)颗粒,并对大肠杆菌MC1061进行裂解形成噬菌斑.[结论]ΦMin27(△stx::cat)可以感染和溶原特定的大肠杆菌,且溶原菌株能释放出原感染性的噬菌体,显示出ΦMin27噬菌体具有携带外源基因在若干不同血清型的大肠杆菌间水平转移的能力,为进一步研究Stx噬菌体的感染机理和志贺毒素表达调控奠定了基础.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体片段CP-933Y,进而构建CP-933Y缺失突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株为模板,加入酶切位点PCR扩增前噬菌体CP-933Y上、下游各600 bp的同源臂序列;酶切后分别连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素(包含FRT位点)抗性基因两侧,构建中间是卡那霉素抗性基因标记含有目的基因上、下游同源序列的线性片段;导入含有p KD46质粒的O157∶H7菌株中,利用Red编码的同源重组酶使该片段与目的基因上、下游发生同源重组,卡那霉素抗性基因置换菌株中CP-933Y前噬菌体片段,最后导入p CP20质粒去除卡那霉素抗性标记基因。结果:经PCR及测序验证,O157∶H7菌株中前噬菌体片段CP-933Y被敲除,敲除株与野生株具有相似的生长曲线。结论:构建了大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失株,为进一步研究前噬菌体CP-933Y的功能奠定了基础。     

大肠杆菌胸腺嘧啶合成酶thyA缺失突变菌株的构建

大肠杆菌K12 DY330菌株的染色体上整合有一种新型的同源重组系统——缺陷型λ原噬菌体同源重组系统。以DY330为出发菌,通过同源重组构建大肠杆菌thyA-株DY330TI,其基因组特点是：thyA基因除保留N端的1～49氨基酸残基相对应的必需核苷酸序列外,将其余部分全部缺失;此外,还敲除了DY330TI中与缺陷型λ原噬菌体同源重组功能相关的基因,从而尽可能避免了通过同源重组产生回复突变的可能性。通过大肠杆菌thyA基因对该突变株的转化实验,检测转化子的回复突变率,进一步证实该突变株的突变性状稳定,为构建以thyA为选择标志的大肠杆菌染色体质粒平衡致死系统提供了合适的缺陷型宿主菌。     

志贺毒素2型噬菌体FMin27的stx2基因突变株构建及其感染特性

【目的】通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性。【方法】利用l噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因（cat）插入到大肠杆菌O157:H7 Min27株的stx2基因中,获得O157:H7 Min27的突变菌株Min27(Δstx∷cat)。用丝裂霉素对该突变菌株进行诱导,结合抗性标记和PCR方法筛选出一株突变的志贺毒素2型噬菌体, 命名为FMin27(Δstx∷cat)。采用双层琼脂平板法和氯霉素抗性筛选的方法,观察FMin27(Δstx∷cat) 感染21株不同血清型大肠杆菌后的裂解和溶原转换情况。【结果】2株血清型分别为Ｏ60和Ｏ138的大肠杆菌可以被FMin27(Δstx∷cat)溶原感染,表现出对氯霉素的抗性,但没有形成噬菌斑,而大肠杆菌MG1655株既可以被溶原又可以被裂解。溶原的菌株经丝裂霉素诱导后,能释放出感染性的FMin27(Δstx∷cat)颗粒,并对大肠杆菌MC1061进行裂解形成噬菌斑。【结论】FMin27(Δstx∷cat)可以感染和溶原特定的大肠杆菌,且溶原菌株能释放出原感染性的噬菌体,显示出FMin27噬菌体具有携带外源基因在若干不同血清型的大肠杆菌间水平转移的能力,为进一步研究Stx噬菌体的感染机理和志贺毒素表达调控奠定了基础。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H7 86-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株（缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp）,并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7 ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

大肠杆菌VT2噬菌体的分离与溶源转染

本试验利用指示菌MC1061,经双层琼脂法纯化和PCR扩增vt2基因,分别从大肠杆菌O157菌株、牛粪、鸡粪和污水中分离获得5株含vt2基因的噬菌体.这些噬菌斑透明,直径为0.5-2 mm,对指示菌的感染效价均在109PFU/mL以上,抵抗氯仿和56℃C30min的作用.将噬菌体分离株SHφW1感染MC1061后,经PCR鉴定获得一株溶源菌株(MC1061/SHφW1).溶源株的LB培养滤液对Vero细胞产生了显著的病变效应,而MC1061在同等条件下培养的滤液无细胞病变,表明VT2噬菌体通过溶源将vt2毒力基因水平转移,证实了VT2噬菌体的转染与细菌毒力相关.     

产Shiga毒素噬菌体ψ297在大肠杆菌K12染色体上整合位点的定位研究

鉴定大肠杆菌O157产生Shiga毒素(Stx)的噬菌体ψ297在大肠杆菌K12染色体上的插入位点.采用加接头PCR方法从与噬菌体933W的整合酶基因int同源的核苷酸开始向未知区域进行步移测序,寻找目的基因.将获得的DNA序列与核苷酸数据库进行比较,确定了细菌性噬菌体ψ297的attL、attR和中心序列位于大肠杆菌K12的yecE基因内.噬菌体ψ297在宿主细胞E.coliK12染色体上的整合位点是yecE基因.     

肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。     

非致病性大肠埃希菌能增多大肠埃希菌O157:H7志贺毒素的产生

大肠埃希菌(简称大肠杆菌)O157：H7毒力因子为志贺毒素2(stx2),其基因由温和噬菌体编码,由晚期基因启动子调控表达。stx2的合成与释放需要诱导噬菌体溶菌周期,而且正常肠道大肠杆菌感染了毒素编码的噬菌体就能制造毒素和噬菌体,使毒素水平远远超过病原性菌株本身的产量,作者在体外以及鼠肠道验证了这一假设。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.