构建从葡萄糖直接发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的基因工程菌研究进展

构建从葡萄糖直接发酵产生维生素Ｃ前体２┐酮基┐Ｌ┐古龙酸的基因工程菌研究进展维生素Ｃ作为人体不可缺少的维生素和抗氧化剂在医药和食品工业上有重要用途,２－酮基－Ｌ－古龙酸（２－ＫＬＧ）是合成维生素Ｃ的重要前体,工业上大多采用“莱氏法”或“两步发酵法”生...     

构建基因工程菌发酵产生维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸

从棒状杆菌ＳＣＢ３０５８克隆得到两个２,５－ＤＫＧ＾＊＊还原酶基因后,构建了两个能够表达２,５－ＤＫＧ还原酶的基因工程大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＥＴ９ａⅡ和ＤＨ５α（ｐＢＬ４）和一个基因工程欧文氏菌ＥＲ９７。２,５－ＤＫＧ还原酶基因分别受控于ＰＬ或Ｔ７启动子,通过加入ＩＰＴＧ或提高温度进行诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达,用细胞抽提液在加入辅酶ＮＡＤＰＨ的体外实验中转     

维生素C前体2-酮基-L-古龙酸二步混菌发酵研究新进展

维生素C（Vc）二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从产酸菌代谢关键酶、伴生菌胞外物质、组学以及外源添加物等方面综述Vc二步混菌发酵的最新研究进展,并提出进一步研究和探索的方向。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。     

D-葡萄糖串联发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸——Ⅱ.菌株SCB3058产生2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究

维生素C(Vitamin C,简称Vc),又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是人体必需的维生素,生理作用广泛,在医药和食品工业上均有重要地位。目前国内厂家多以我国发明的“二步发酵法”进行生产,即以D-山梨醇为原料生产2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KLG),然后制备维生素C。而近年来引起国内外普遍关注的是从D-葡萄糖串联发酵生产2-KLG的新工艺,以及采用基因工程技术,构建直接由D-葡萄糖转化生成2-KLG的基因工程菌的研究(图1)。1987年以来我国学者尹光琳等人采用了欧文氏菌(Erwinia sp.)和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸,并开展了一系列的研究。     

混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸研究进展

利用混合菌发酵L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸(2-KCA),再经化学转化合成维生素C(Vc),是我国工业生产Vc的主要途径,具有简化工艺,减少污染,降低能耗等诸多优点.从菌系组合、菌种选育、代谢途径与酶学特性、工程菌构建、伴生作用机制及发酵工艺等方面出发,综述混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-KGA的研究现状和最新进展,并提出进一步研究和探索的方向.     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一     

微生物混合培养从D-山梨醇产生维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究

在成功利用SCB329和SCB110混合培养完成从D-山梨醇转化产生2-酮基-L古龙酸的基础上,为了消除副产物和获得高的产量,首先对两菌搭配比例,初始pH值,培养基成分等发酵培养条件进行单因子实验,在此基因上采用L9（3^4)正交实验优化其发酵培养基,其最终的优化培养基的成分为：D-山梨醇9g,玉米浆1.5g,尿素1.5g,磷酸二氢钾0.1g,碳酸钙0.2g。用优化后的培养基发酵,没有检测出副产物2-酮基-D-古龙酸,2-酮基-L-古龙酸产量提高了20%。     

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)SCB329以D－山梨醇为底物培养时可产生微量2－酮基－L－古龙酸;而葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter sp.)SCB110能将D－山梨醇以较高效率转化为L－山梨糖,但不产2－酮基－L－古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等,确定其主要的代谢产物是2－酮基－L－古龙酸。     

2—酮—L—古龙酸还原酶分离纯化及其理化,酶学性质的研究

从发酵Ｌ－山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ和Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２９８０混和菌株的无细胞抽提液中分离到了２－酮－Ｌ－古龙酸还原酶（ＫＧＲ）,测得其分子量为９０ｋＤａ。动力学性质研究表明它为一个典型的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ氏酶,对２－酮－Ｌ－古龙酸作用的Ｋｍ值为３．４２×１０＾－３ｍｏｌ,最适作用ｐＨ为６．５,最适作用温度为３０℃。２－酮－Ｌ－古龙酸还原     

微生物发酵产光学纯度D-乳酸研究进展

D-乳酸作为一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料,其生产已越来越受到人们的重视。然而,低光学纯度D-乳酸在很多领域的应用都受到限制。微生物发酵法能够生产高光学纯度的D-乳酸。除了乳酸生产的传统菌株-乳酸细菌,研究者们还通过基因工程的手段不断探索其它种属菌株利用更廉价的可再生资源高产光学纯度D-乳酸的可行性。介绍了D-乳酸的物化性质及其在工业生产、化学加工和聚乳酸合成中的应用,并详细综述了国内外发酵法生产光学纯度D-乳酸的最新研究进展,着重介绍了采用基因工程育种策略提高菌株的D-乳酸产量、转化率、生产强度以及光学纯度,降低副产物的合成,扩大底物利用范围的研究成果。所涉及的菌株包括:乳酸细菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌以及酵母等。这些研究表明,应用基因工程手段改造生产菌株的代谢途径是选育D-乳酸发酵生产菌株的发展趋势。最后还对D-乳酸发酵生产的前景进行了展望。     

混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用

为查明维生素Ｃ二步发酵混合培养中巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌间的关系,通过生长曲线测定、静息细胞实验及摇瓶发酵实验研究了巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产生２－酮基－Ｌ－古龙酸作用的影响;采用超滤分离、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸作用的活性物质进行了分离和纯化。结果表明,大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,大菌胞外液中具有该作用的组分分子     

衣康酸发酵研究进展

衣康酸作为一种平台化合物,可被各行业广泛用于多种高附加值产品的生产,其更是具有替代传统石油基原料的潜力,在工业生产中有着重要地位与应用前景.目前,衣康酸主要由土曲霉深层好氧发酵生产,碳源、氮源、磷酸盐、金属离子、溶解氧、pH、温度等条件对其产量影响显著.在衣康酸生产中,原料成本高是阻碍其市场进一步扩大与发展的重要因素....     

微生物发酵琥珀酸的研究进展

琥珀酸是一种重要的C_4平台化合物,生物基琥珀酸可作为合成大宗化学品的起始原料,在食品、医药、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂、生物可降解塑料和动植物生长刺激物剂领域有广泛的应用前景。从可再生原料出发,发酵过程固定CO_2,使得微生物发酵生产琥珀酸具有良好的环境优势,成为近年研究的热点。围绕微生物发酵法生产琥珀酸迫切需要解决的主要问题,综述了国内外对琥珀酸生产菌的选育、其代谢机理与产酸条件、发酵过程工艺、产品提取等方面的研究现状。     

重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展

琥珀酸作为一种优秀的C4平台化合物, 广泛用于生物高分子、食品与医药等行业, 市场潜在需求量巨大。采用微生物发酵法生产琥珀酸, 可利用廉价的可再生资源, 实现石油的原料替代, 而且过程污染小, 环境友好, 且在发酵过程中可吸收固定温室气体CO2, 开辟了其利用的新途径, 近年来引起了广泛关注。在丁二酸生产菌株中, 大肠杆菌由于其遗传背景清楚, 易操作易调 控, 培养基要求简单, 生长迅速等优点, 近年来被广泛用于研究以获得产琥珀酸优秀生产菌株。本工作系统综述了产琥珀酸大肠杆菌构建中所采用的基因工程策略及代谢工程技术, 并探讨了今后研究的方向。     

D-乳酸产生菌的研究进展

D-乳酸作为一种重要的工业有机酸,是许多手性物质的中间体,特别是高光学纯度D-乳酸因其可以提高聚乳酸材料的性能而广泛应用。微生物发酵法是目前D-乳酸的主要生产方法,而菌种在发酵生产中占有非常重要的地位,是决定整个生产过程的关键。就近几十年来产D-乳酸常用菌株、菌种进化、研究方法、存在问题及前景做一综述。     

Characterization of a group of pyrroloquinoline quinone‐dependent dehydrogenases that are involved in the conversion of L‐sorbose to 2‐Keto‐L‐gulonic acid in Ketogulonicigenium vulgare WSH‐001

Ketogulonicigenium vulgare WSH‐001 is an industrial strain used for vitamin C production. Based on genome sequencing and pathway analysis of the bacterium, some of its potential pyrroloquinoline quinone (PQQ)‐dependent dehydrogenases were predicted, including KVU_pmdA_0245, KVU_2142, KVU_2159, KVU_1366, KVU_0203, KVU_0095, and KVU_pmdB_0115. BLAST and function domain searches showed that enzymes encoded by these genes may act as putative PQQ‐dependent L ‐sorbose dehydrogenases (SDH) or L ‐sorbosone dehydrogenases (SNDH). To validate whether these dehydrogenases are PQQ‐dependent or not, these seven putative dehyrogenases were overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified for characterization. Biochemical and kinetic characterization of the purified proteins have led to the identification of seven enzymes that possess the ability to oxidize L ‐sorbose or L ‐sorbosone to varying degrees. In addition, the dehydrogenation of sorbose in K. vulgare is validated to be PQQ dependent, identification of these PQQ‐dependent dehydrogenases expanded the PQQ‐dependent dehydrogenase family. Besides, the optimal combination of enzymes that could more efficiently catalyze the conversion of sorbose to gulonic acid was proposed. These are important in supporting the development of metabolic engineering strategies and engineering of efficient strains for one‐step production of vitamin C in the future. © 2013 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 29:1398–1404, 2013     

代谢工程改造酿酒酵母生产L-乳酸的研究进展

L-乳酸是一种重要的有机化合物,具有广泛的应用价值。微生物发酵法生产是当前L-乳酸的主要来源,但受限于精确的发酵条件、菌体产物耐受能力低及底物要求高等因素,导致L-乳酸供给不足且价格偏高。鉴于酿酒酵母利用廉价底物生产有价值物质方面的诸多优势,并随着分子生物学技术的发展,利用代谢工程改造酿酒酵母本身固有的代谢网络,使其高产L-乳酸已成为当前研究的热点。从L-乳酸的异源生产、关键途径改造及菌体生长能力恢复三个方面归纳了关于代谢工程改造酿酒酵母生产L-乳酸的研究进展。最后,指出了酿酒酵母异源生产L-乳酸存在的不足和今后研究的方向。