胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素作用原理的研究 Ⅵ.胰岛素片段与胰岛素受体的相互作用

研究了用胰凝乳蛋白酶限制性酶解和化学合成方法所获得的若干胰岛素片段与脂肪细胞胰岛素受体的结合。它们在低浓度时几乎观察不出与胰岛素受体结合,而在高浓度时除五肽HTyr·Thr·Pro·Lys·AlaOH外都有明显的专一性结合。说明它们具有部分与胰岛素受体的结合部位。与前文关于胰岛素结合部位设想是一致的。讨论了胰岛素结合部位的性质,并讨论了五肽HArg·Gly·Phe·Phe·TyrOH加强胰岛素与其受体亲合力的可能性。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究 Ⅴ.用萤光探针1,8-TNS对疏水区的初步研究

1,8-TNS与溶剂极性和粘度关系的研究,证明正如它们的位置异构物2,6-TNS一样具有萤光疏水探针的性能。我们用此探针比较研究了胰岛素、去B链羧端五肽胰岛素(DPI)、牛血浆白蛋白、溶菌酶、卵白蛋白的疏水表面性质。结果表明DPI和胰岛素相似,存在一个小而确定的疏水区。提示B链羧端五肽的去除并未严重改变其与受体结合有关的疏水面结构。在生理pH值其疏水面暴露较胰岛素略大。但其疏水面构象稳定性较胰岛素弱,随pH升高,分子局部构象可能发生扭动,疏水面构象遭到一定程度的破坏。总的来讲,DPI结构较胰岛素松散,稳定性亦下降。     

去B链羧端七肽(B24～30)胰岛素的制备——羧肽酶-A限制性水解去五肽胰岛素

用羧肽酶-A对去B链羧端五肽胰岛素进行限制性酶解,得到去B链羧端七肽胰岛素,反应条件是pH7.4,0℃,10小时。水解产物经Sephadex G-50柱分离,并经羧端顺序与氨基酸组成分析鉴定。用小白鼠惊厥法测定,这一去七肽胰岛素制剂有4.7%的胰岛素活力。     

胰岛素作用原理的研究 Ⅵ.胰岛素片段与胰岛素受体的相互作用

研究了用胰凝乳蛋白酶限制性酶解和化学合成方法所获得的若干肤岛素片段与脂肪细胞胰岛素受体的结合。它们在低浓度时几乎观察不出与胰岛素受体结合,而在高浓度时除五肽HTyr·Thr·Pro·Lys·AIaOH 外都有明显的专一性结合。说明它们具有部分与胰岛素受体的结合部位。与前文关于胰岛素结合部位设想是一致的。讨论了胰岛素结合部位的性质,并讨论了五肽HArg·Gly·Phe·Phe·TyrOH 加强胰岛素与其受体亲合力的可能性。     

[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去β链C端五肽胰岛素的合成和性质

本文报道了[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去B链羧端五肽胰岛素的制备及其生物活性。结果表明,这一类似物的生物活力比去五肽胰岛素(DPI)的活力高一倍,但却比Gerald所报道的[B10-Asp,B25-Tyr-NH_2]-DPI的活力低很多,说明后者的高活性可能依赖于分子中B22-Arg的存在。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅱ.晶体生长及其初步结晶学观察

培养了两种可供初步又一光衍射实验用的去五肽胰岛素的晶体,并对其进行了结晶学参数的测定。     

B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素晶体结构的分子置换法研究

以B链羧端去五肽胰岛素(DPI)结构为模型,应用分子置换法对B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素(DesB1～2DPI)晶体结构进行了研究.DesB1～2DPI晶体单位晶胞中每个结晶学不对称单位包含1个DesB1～2DPI分子.交叉旋转函数和平移函数搜索均找到了明显突出的峰,确定了DesB1～2DPI分子在晶胞中的取向和位置.进一步的三维模型重建和结构精化结果巩固了DesB1～2DPI的分子置换法研究的正确性.     

B27K—去B链C端三肽胰岛素的制备、生物活力与自聚合性质

液相合成五肽Gly Phe Phe Tyr Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B2 7K 去B链C端三肽胰岛素(B2 7K DTrI,B2 7K destripeptideinsulin)。用小鼠惊厥法和小鼠降血糖法测得B2 7K DTrI的整体生物活力为标准胰岛素的 80 % ,B2 7K DTrI与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的 ( 12 5± 13 ) %。用凝胶过滤法证明B2 7K DTrI自聚合性质降低 ,具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B2 7K DtrI结构中 ,B2 7T被K取代 ,其优点是在酵母中表达其前体后 ,可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得     

胰岛素作用原理的研究——Ⅰ.胰岛素及其类似物与其受体的相互作用

研究了一些胰岛素B链羧端肽段改变了的类似物与肝细胞及脂肪细胞的受体蛋白结合性质。这些结果说明,去B链羧端五肽胰岛素与胰岛素有相同的结合能力;去B链羧端六肽胰岛素及B_(23)被D-丙氨酸取代的去B链羧端六肽胰岛素有明显的结合;去B链羧端八肽胰岛素具极微的结合能力;胰岛素A链、促肾上腺皮质素、增血糖素不与胰岛素受体蛋白结合。在此基础上还讨论了B_(24)芳香环参与胰岛素结合部位的可能性,并假设B_(12),B_(16),B_(24),B_(25)疏水平面可能是结合部位的重要内容。而B_(20)～B_(23)U形转折及A_(21)…B_(22)盐键的作用是稳定疏水平面结构。胰岛素与受体的结合类似于胰岛素二体中两个单体的结合。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30,与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅲ.高分辨核磁共振研究

研究了胰岛素(Ins)和去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的250兆周核磁共振,发现DPI、Ins核磁共振谱之间存在着差异。这说明胰岛素分子羧端五肽的切除引起在溶液中局部构象变化。这种构象变化似乎不影响Ins分子的生物活性。许多研究表明Ins分子在溶液中存在着解离聚合平衡,聚合状态与溶液浓度、pH有密切关系。如果改变DPI和Ins溶液的浓度及pH,前者波谱变化不明显,后者随溶液浓度、pH增加而增加。Ins波谱中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3部分与芳香环质子部分共振峰均加宽。这些说明DPI在无Zn~( )溶液中不存在解离聚合平衡,而可能以单体形式存在。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B 链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B 链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30(?),与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B 链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅰ.制备及性质

本文报道了一种改进的去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的制备方法。按此法可获适宜单晶培养用的DPI制剂。其结晶制剂的受体结合活力为胰岛素的88%。其小白鼠惊厥活力为20I.U./毫克。在Zn~( )存在下和胰岛素有免疫交叉反应。     

〔B25－Trp〕去B链C端五肽胰岛素酰胺的合成及性质

去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）与Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２通过胰蛋白酶催化缩合后,经分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的Ｂ２５－Ｔｒｐ取代的去Ｂ链Ｃ端五肽胰岛素酰胺（〔Ｂ２５－Ｔｒｙ〕ＤＰＩ－ＮＨ２）．酶促缩合率大于８５％,回收率为３６．２％。用小白鼠惊厥法测得〔Ｂ２５－Ｔｒｐ〕ＤＰＩ－ＮＨ２的体内活力约为天然胰岛素的７０％,用人胎盘细胞膜测得的其胰岛素受体结合能力为天然胰岛素的７２．５±２．４％;利用色氨酸和酪氨酸的内源荧光研究了此类似物的溶液构象．     

胰岛素与类似物结构与功能关系的核磁共振研究

对胰岛素及其类似物DPI(去五肽胰岛素),DOI(去八肽胰岛素)的~1H NMR(核磁共振)变温谱进行了比较研究。胰岛素的三维结构随温度上升发生明显的变化,以Val、Leu、Ile的CH_3组成的高场峰区(0.2～1.1ppm)的峰形逐渐变尖变窄,特别突出的是0.34～0.42ppm峰肩当温度升高至50℃以上逐渐向低场移动以至消失。此峰肩为A_2-Ile的两个CH_3受邻近A_(19)-Tyr芳香环的环流场屏蔽影响的高场位移峰。DPI变温谱具有与胰岛素十分相似的变化。而对比DOI的变温谱,我们发现常温时,由于A链头尾紧密联系的极性区构象已遭破坏,因而不出现此峰肩。此局部构象可能与DPI保存有相当大的生物活性和DOI丧失生物活性有关。胰岛素的A链头尾三维构象随温度上升至50℃以上的明显变化与胰岛素和受体结合活性在温度高于50℃被破坏的结果是一致的。这就提示了结合活性的变化与某些三维构象的变化可能是相关的。这也支持了A链头尾形成的极性区很象是胰岛素“结合部位”的一部分。     

猪B_1色氨酸去五肽胰岛素的制备及性质

本文采用甲基磺酰乙氧羰酰基(MSC)作为酸稳定性氨基可逆保护基,在二甲亚砜溶剂中与去五肽胰岛素(DPI)氨基选择性反应。经Sp-Sephadex C-25纯化得[MSC]~(?),单取代去五肽胰岛素。再经Edman 降解制得[MSC]~(?)desB_1DPI。作为半合成起始物与甲基磺酰乙氧羰酰色氨酸对硝基苯酯(Msc·Trp·ONP)在N-乙基吗啉存在下,在二甲亚砜溶液中进行缩合。缩合产物经Sp-Sephadex C-25分离,所得[MSC]_2Trp~(B_1)DPI 在0℃下以二氧六环∶甲醇∶水∶2N氢氧化钠(3∶0.5∶3.5∶1,V/V)混合溶剂脱保护。脱保护产物经Sephadex G-50纯化,制得[Trp]~(B_1)DPI。氨基酸组成和紫外吸收光谱分析,证实产物是[Trp]~(B_1)DPI。[Trp]~(B_1)DPI 经肝膜胰岛素受体结合活力分析,其受体结合活力为胰岛素的26%.     

分子置换法在去B链羧端五肽胰岛素晶体结构测定中的应用

收集了一套去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶体的X射线衍射数据。利用已知的胰岛素结构和DPI强度数据,应用分子置换法对测定DPI的晶体结构作了尝试。为了测定分子在晶胞中的取向和位置,在TQ-16和013计算机上编制了一套ALGOL程序。在算得的旋转函数图上没有找到突出的峰,用去掉B链前三个氨基酸残基和大部分表面侧链的胰岛素分子的原子坐标数据作试验,得到了改进的10～4图。在此基础上,采用不同的方法探索分子在单斜晶胞里的位置,最后得到了一个可能的分子在晶胞里的堆积模型。结果表明,胰岛素和DPI分子结构之间的差异可能较大,DPI晶体中晶体学二重轴联系的两个分子不能形成一个象三方二锌猪胰岛素晶体那样的二聚体。