转铁蛋白结构与功能的研究——骆驼血清转铁蛋自的分离纯化及其含单一铁结合部位的结构域的制备和鉴定

分离纯化获得的骆驼血清转铁蛋白由分子量为73,000和63,000两个组分组成。两者至少N-端五肽顺序相同(Met-Pro-Asp-Lys-Thr)。骆驼血清转铁蛋白在生理pH下不能与人胎盘转铁蛋白受体结合。用胰蛋白酶酶解骆驼转铁蛋白可以同时得到两个合单一铁结合部位的结构域,分别来自转铁蛋白分子的N-端称N-端结构域(分子量34,700和40,700)和C-端称C-端结构域(分子量35,100)。在上述结果的基础上指出并讨论了反刍动物转铁蛋白在结构和功能上存在更多的共同性,而与其它哺乳动物的转铁蛋白有着明显的区别。     

文昌鱼转铁蛋白及转铁蛋白的分子进化

从厦门文昌鱼分离纯化了文昌鱼转铁蛋白,物化性质与青岛文昌鱼转铁蛋白相同,其单体和二聚体的分子量分别为２６ｋＤ和５２ｋＤ,是一分子量约为脊椎动物转铁蛋白１／４的糖蛋白,测定了文昌鱼转铁蛋白完整分子和其Ｃ端分子片段的部分氨基酸序列并分析 一人务清失蛋白氨基酸序列的同源性。发现用文昌鱼转铁蛋白序列可将人血清转铁蛋白序列划分成粗略相等的４个片段,文是鱼转铁蛋白与每一片段及人血清转铁蛋白的４个片段之间存在明     

转铁蛋白结构域的研究及转铁蛋白的进化

转铁蛋白是单一肽链糖蛋白,含有两个相似的结合铁的结构域,可能是在进化过程中基因发生过重复。转铁蛋白结构域的研究和基因结构分析为这种假说提供了证据。从尾索动物亚门的海鞘内分离到单结构域形式转铁蛋白,因此推测基因重复可能发生在五亿年前的尾索动物亚门内。结构域的研究工作说明现在的转铁蛋白结构域已不同于其原始形式,单独不能起作用,只有两结构域协同才能行使转铁的功能。     

家蝇转铁蛋白基因的克隆和生物信息学分析

为了研究家蝇转铁蛋白基因功能,获得全长cDNA序列并对其蛋白序列进行生物信息学分析,利用在线分析程序和相关工具软件分析转铁蛋白基因的开放读码框,分析编码蛋白的理化性质、结构域、并预测其空间结构和功能。结果表明家蝇转铁蛋白基因编码蛋白由622个氨基酸组成,分子量为70.58kDa,理论等电点为5.33,为稳定蛋白,有跨膜区,含有信号肽,该蛋白属于TR-FER保守结构域家族,亚细胞定位于细胞核,二级结构以无规则卷曲为主,功能预测该蛋白具有酶活性。     

草鱼转铁蛋白基因的克隆及其组织表达

转铁蛋白(Transferrin,Tf)功能广泛,不仅参与机体内铁离子的运输和代谢,还在细胞呼吸、细胞生长和增殖中起重要作用,而且它具有抗菌杀菌的功能。研究从草鱼肝肾全长cDNA文库中克隆得到草鱼转铁蛋白基因(CtTf),该基因全长cDNA5′非编码区包含31bp,最大开放阅读框为2025bp,编码674个氨基酸,3′非编码区为266bp。研究使用了Signal P、SMART等在线软件对草鱼转铁蛋白全长cDNA的分子特征进行预测,结果显示CtTf编码的蛋白质N-端有1个由15个氨基酸残基组成的信号肽,第24-334个和第338-665个氨基酸为2个保守的结构域,二者同源率为31%。与其他物种的转铁蛋白类似,草鱼转铁蛋白每个结构域包含4个铁离子结合位点,它们在两个结构域中的位置相对保守,除了这8个铁离子结合位点外,还存在多个完全保守的氨基酸位点。草鱼转铁蛋白与人及其他物种有很高的同源性,与其他鲤科鱼类的同源性为65%-73%;与海洋鱼类同源性为43%-50%;与两栖、爬行、鸟类、哺乳类的同源性为40%-42%。系统进化树也显示草鱼转铁蛋白基因与斑马鱼和鲤鱼的亲缘关系最近。RT-PCR的实验结果表明,在草鱼肝、肠、肾、脾、心、肌肉、鳃和脑8种组织中,草鱼转铁蛋白基因在肝中的表达量最高,其次为脾和肠,在鳃和脑中有痕量表达。       

猪血清转铁蛋白含单一铁结合部位的半分子的制备、鉴定和受体结合能力

用胰蛋白酶水解铁饱和的猪血清转铁蛋白 ,可同时获得含单一铁结合部位的N端和C端半分子。比较了猪血清转铁蛋白及其N端和C端半分子与人胎盘细胞膜转铁蛋白受体的结合能力 ,其受体结合能力依次为 :猪血清转铁蛋白 >C端半分子 >N端半分子     

核盘菌AROM蛋白的三级结构分析

核盘菌编码AROM蛋白的arom基因已经被克隆测序,本文根据该基因翻译的氨基酸序列用同源模建方法和从头模建方法分析了AROM蛋白各结构域的三级结构和功能位点,以及该蛋白二聚体可能的组装方式。结果表明,核盘菌AROM蛋白的脱氢奎尼酸合酶结构域进一步由N-端含有一个Rossmann折叠的α/β结构域和C-端的α螺旋结构域组成;5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶结构域则由两个相似结构域组成,每个结构域含有不同拷贝数的β折叠和α螺旋;莽草酸激酶结构域的N-端由三个β折叠组成;脱氢奎尼酸酶结构域为(α2β2)3多肽,在N-端有一对反平行的β链,在C-端有loop环;莽草酸脱氢酶结构域含有一个由α/β组成的催化结构域和一个含有Rossmann折叠的NADPH结合结构域。     

中华鳖转铁蛋白基因序列特征及表达研究

转铁蛋白是呼吸链的关键因子, 参与体液和免疫系统的调节, 具有抗菌抗病毒等功能。研究从嗜水气单胞菌诱导的中华鳖肝脏SMART cDNA文库中, 分离克隆了中华鳖转铁蛋白基因cDNA和gDNA全序列, 对其序列特征、组织表达及原核表达进行了分析研究。结果显示, 中华鳖转铁蛋白对应全长cDNA的基因组DNA全长为19100 bp, 由17个外显子和16个内含子组成; cDNA全长为2359 bp, 开放阅读框为 2094 bp, 编码697个氨基酸; 转铁蛋白的分子量为76.6 kD, 包含2个糖基化位点, 存在4个二硫键形成区域的缺失, 两个同源结构域的相似性为37%, 信号肽位于第119位点。荧光定量PCR结果显示, 正常组中华鳖转铁蛋白基因在肝脏中的表达量最大; 以嗜水气单胞菌刺激后, 其在心、肝、脾和肾脏组织中的表达, 均有一个上调后减少的趋势。此外, 实验还进行了重组转铁蛋白原核表达和Western blot 检测鉴定, 为深入研究中华鳖转铁蛋白功能的提供了基础数据。       

白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白的分离纯化及其结构和性质的比较

1.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白在分离纯化上的差异。2.用SDS-PAGE测定分子量,白鲢鱼血清转铁蛋白有两个组份,分子量分别为77kD和70kD;黄鳝血清转铁蛋白为单一组份,分子量为68.1 kD。3.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白都含糖,但都不与ConA-Sepharose柱结合。4.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白氨基酸组成的测定和比较。5.白鲢鱼与黄鳝血清转铁蛋白用胰蛋白酶在相同条件下进行酶解,白鲢鱼能得到分子量在37kD左右的二个片段,而黄鳝则几乎不能被胰蛋白酶酶解。6.白鲢鱼血清转铁蛋白在404.5nm处有一特异吸收峰,而黄鳝则在407.5nm处。     

α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

目的：确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法：构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果：成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论：α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。     

DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区（N-端181aa）与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。     

Cloning, sequence analysis and expression profiling of glutathione Stransferase omega 1 gene from Locusta migratoria (Orthoptera:Acridoidea )

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类广泛分布的多功能超家族酶系,其中Omega家族GST在昆虫体内担负重要生理功能.为探讨飞蝗Locusta migratoria Omega家族GST功能,利用RT-PCR技术克隆得到1条飞蝗谷胱甘肽S-转移酶Omega家族基因全长cDNA,命名为LmGSTol(GenBank登录号:JQ750592).该基因开放阅读框长738 bp,编码245个氨基酸.该酶含有N-端和C-端2个结构域,N-端结构域由5个β-折叠和3个α螺旋组成,包括4个GSH结合位点;C-端结构域由8个α螺旋组成,含有5个底物结合位点.Real-time PCR 结果表明,LmGSTo1在飞蝗不同龄期均有表达,在胃盲囊和中肠表达量较低,在前肠、马氏管、肌肉和脂肪体表达量较高;溴氰菊酯处理可导致LmGSTo1表达水平显著下降.这些结果为进一步研究LmGSTo1基因功能提供了依据.     

葡萄球菌A蛋白基因

<正>金黄色葡萄球菌A蛋白是一种细胞膜成分,据报道分子量约为42000。此蛋白有伸展的形态,而且顺序分析已揭示出在其分子中有两个功能独特区。N-端分子量为27000,由四种连续的高度同源的IgG结合单位组成,每一单位分子量大约7000。C-端分子量为15000,是一个能共价结合多糖肽而无结     

飞蝗谷胱甘肽S-转移酶基因克隆、 序列分析及表达特征

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）是一类广泛分布的多功能超家族酶系, 其中Omega家族GST在昆虫体内担负重要生理功能。为探讨飞蝗Locusta migratoria Omega家族GST功能, 利用RT-PCR技术克隆得到1条飞蝗谷胱甘肽S-转移酶Omega家族基因全长cDNA, 命名为LmGSTo1 （GenBank登录号： JQ750592）。该基因开放阅读框长738 bp, 编码245个氨基酸。该酶含有N-端和C-端2个结构域, N-端结构域由5个β-折叠和3个α螺旋组成, 包括4个GSH结合位点; C-端结构域由8个α螺旋组成, 含有5个底物结合位点。Real-time PCR结果表明, LmGSTo1在飞蝗不同龄期均有表达, 在胃盲囊和中肠表达量较低, 在前肠、马氏管、肌肉和脂肪体表达量较高; 溴氰菊酯处理可导致LmGSTo1表达水平显著下降。这些结果为进一步研究LmGSTo1基因功能提供了依据。     

甘蓝型油菜BnFLA基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从甘蓝型油菜中获得了1个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(FLA),命名为BnFLA。BnFLA基因开放阅读框长为1 200bp,编码399个氨基酸,分子量为42 885.9Da,等电点为6.37。预测的BnFLA蛋白包含N-端信号肽、2个AGP-like结构域、2个fasciclin-like结构域和C-端GPI-anchor序列。系统进化分析表明BnFLA氨基酸序列与BrFLA17和AtFLA2进化关系较近,一致性分别为98%和87%。qRT-PCR分析表明,BnFLA基因在油菜各组织均有表达,并以下胚轴中表达量最高,其次为子叶,茎秆中表达最少;BnFLA基因的表达受到GA3、BR、IAA、ABA和NaCl的诱导,但受6-BA、蔗糖、低温和PEG抑制。研究认为,油菜中BnFLA基因可能参与激素信号转导途径和非生物胁迫应答。     

黑鲷转铁蛋白基因的分子特征研究

目的:克隆黑鲷转铁蛋白全基因并分析其分子特征。方法:采用同源克隆的方法,对黑鲷转铁蛋白全基因编码序列进行克隆,在cDNA获得了部分转铁蛋白基因的同源片段。经RACE PCR方法,分别对该基因的3’和5’末端进行扩增,获得的扩增片段经拼接后得到全基因片段。结果:黑鲷转铁蛋白全长2431bp,可编码691个氨基酸,分子量(MW)约为74.3kDa,等电点(PI)为5.63。它与鱼类转铁蛋白的同源性最高,约为65%-89%;与其它动物(哺乳类、两栖类等)也有一定的相识性。进化分析表明黑鲷转铁蛋白与其它鱼类和哺乳类的转铁蛋白是由早期转铁蛋白共同的祖先进化来的。结论:黑鲷转铁蛋白主要在肝脏中成组成型表达,在大脑等器官中也有少量表达。该基因的表达受病原刺激的影响,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

马氏钳蝎哺乳动物神经毒素Ⅱ的部分氨基酸顺序

用DABITC-PITC双偶合微量手工顺序方法和羧肽酶法,测定了马氏钳蝎哺乳动物神经毒素Ⅱ的N-端和C-端部分氨基酸排列顺序。N-端氨基酸顺序为:H-Val-Arg-Asp-Ala-Tyr-lle-Ala-Asp-Pro-Asn-Asn-(Cys)-Val-Tyr-Glu-(Cys)-Ala-。C-端氨基酸顺序为:-Arg-Ile-Ser-Ile-OH。     

丙氨酸消旋酶C-端结构域重组体的构建及其功能初探

【目的】将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能。【方法】利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学参数。【结果】通过基因拼接构建了12个重组基因,经检测,表达、纯化获得的重组酶蛋白中只有OF4TtDadX240c具有催化活性,其活性仅为OF4DadX的60.54%,酶催化动力学结果显示OF4TtDadX240c催化反应速率Vmax/Km下降约10倍,但其稳定性大幅提高,半衰期比OF4DadX延长约5倍,耐热性提高较明显;聚合状态表明OF4DadX、OF4TMDadX226c和OF4TtDadX240c为二聚体结构,其他酶蛋白均为单体,但OF4TMDadX226c未检测到活性,推测可能是酶催化活性中心移位,未能形成质子转移而失去活性。【结论】丙氨酸消旋酶C-端折叠结构域对消旋酶低聚化、稳定性和酶催化功能具有重要作用。     

白念珠菌HSP90与人源HSP90的克隆表达及其C端的比较分析

目的分别体外表达纯化白念珠菌HSP90(CaHSP90)和人源HSP90(hHSP90)并分析C-端序列差异对其体外状态下分子聚合度的影响。方法我们将CaHSP90、hHSP90野生型及其C-端酶切碱基序列通过PCR进行扩增并通过NdeI/XhoI酶切位点连接到到pET22b+质粒中。将构建好的上述质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达并通过Ni 2+-NTA柱以及Superdex-200快速柱层析系统(FPLC)纯化。所得蛋白通过SDS-PAGE以及分子排阻色谱(SEC)测定分子量和聚合状态。结果通过测序鉴定所有质粒构建成功,并最终纯化得到足够纯度的蛋白进行SEC分析实验。分析结果表明野生型CaHSP90和hHSP90在体外具有相似的聚合度,而C-端突变后则存在明显差异。结论 CaHSP90和hHSP90的C-端结构域对其体外聚合状态有着不同的影响,CaHSP90的C-端结构域有可能成为CaHSP90抑制剂一个潜在靶点。     

转铁蛋白/转铁蛋白受体介导的药物运输

转铁蛋白 转铁蛋白受体介导的铁吸收过程是哺乳动物吸收铁的主要途径。近几十年的研究 ,对此过程有了充分了解。作为靶向配体 ,转铁蛋白可以介导多种金属的运输。最新研究表明转铁蛋白可以与抗癌药物、蛋白质、基因等形成复合物 ,靶向肿瘤、血脑屏障、快速分裂等大量表达转铁蛋白受体的组织。转铁蛋白偶联的药物具有靶向性强、毒副小的优点。综述了转铁蛋白 转铁蛋白受体介导的药物运输的最新研究进展。