一种新的人CNA1基因转录本的克隆和功能鉴定

钙调神经磷酸酶（calcineurin,CN）是唯一依赖于Ca2+和钙调蛋白（calmodulin,CaM）的丝氨酸/苏氨酸型蛋白磷酸酶,由1个催化亚基CNA和1个调节亚基CNB组成. CNA 有3种亚型,最常见的是由CNA1基因编码的α亚型（CNAα）. 在克隆CNA1基因cDNA的过程中,发现了1种新的人CNA1转录本-CNAα4. 与CNA1基因的其它转录本相比,CNAα4缺失第2外显子,其编码蛋白质由454个氨基酸组成,具有比其它3种CNAα亚型更短的磷酸酶催化结构域. CNAα4具有与CNAα1相似的CaM亲和力,但是其激活活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）的活性明显强于CNAα1,提示CNAα4所缺失的氨基酸序列（Ala20 Thr86）并非CNA催化结构域所必需,相反,Ala²⁰-Thr⁸⁶缺失可能有助于其酶活性中心与NFAT的结合并发挥作用.     

NFAT家族蛋白的作用机制

NFAT家族蛋白是一类具有广泛生理功能的转录因子,不同的NFAT蛋白各具其特定的选择性基因调控功能.NFAT除了在免疫应答过程中扮演着中心角色外,可能还具有众多其他功能.NFAT主要通过Ca2+-CN信号路径被激活,NFAT的激活与核质穿梭主要是通过CN与组成型激酶的动力学相互作用来调控的.NFAT在激活靶基因时常常与AP-1蛋白或其他转录因子发生协同作用.     

活化的T细胞核内因子（NFAT）的调节及其在神经系统中的功能

活化的T细胞核内因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）作为细胞信号转导通路中的一类重要的转录因子参与细胞功能的调节. NFAT的活化主要是通过细胞内钙/钙调神经磷酸酶（Ca2+/calcineurin）的刺激启动,它脱磷酸后发生核转位并与DNA的特定序列结合,同时通过与其它转录因子的协同作用,调节目的基因的特定表达. NFAT在免疫系统中所调节的基因表达已经得到了充分的研究. 近年实验研究发现,NFAT的转录因子家族在脊椎动物的神经系统中也发挥着非常重要的作用. 本文综述了NFAT家族蛋白的分类、结构、磷酸酶与激酶对其出入核的调节及在神经系统中的研究进展,使得能够更加全面地认识calcineurin/NFAT信号通路的作用. 此外,由于环孢菌素A（cyclosporin A）等药物在神经系统应用的局限性,对于NFAT调节深入研究,也将为筛选或者开发更为高效、低毒药物提供新的思路.     

不同免疫抑制剂对钙调神经磷酸酶及其突变体的影响

利用定点突变技术构建并纯化了钙调神经磷酸酶A 亚基Loop7区及其附近的几个突变体, 进行了磷酸酶比活性及溶液构象的研究, 并通过它们与野生型的比较, 研究CN和免疫抑制药物的相互作用. 结果表明:删除Loop7中心区1个或几个氨基酸的突变体, 其磷酸酶比活性均高于野生型, 远紫外CD谱显示各突变体溶液构象均发生了改变. 免疫抑制剂复合物CsA-CyP明显抑制野生型CN的酶活, 而对Loop7区各突变体影响不大, 说明Loop7区定点突变改变了CsA-CyP和CN之间的相互作用. 对从传统中药中提取的成分进行检测发现, 中药成分ZIP1能对CN野生型和突变体都起直接的抑制作用, 而不需要体内结合物的存在. 提示CN的Loop7区是CsA-CyP起抑制作用的关键部位, 中药成分ZIP1对CN的抑制作用很值得深入研究.     

不同强度运动对骨骼肌纤维MHC亚型转化及CaN/NFATc1信号通路的影响

目的：研究不同强度运动对骨骼肌纤维MHC亚型转化及钙调神经磷酸酶（CaN）/活化T细胞核因子1（NFATc1）信号通路的影响。方法：雄性SD大鼠（2月龄）24只,随机分为3组（n=8）：正常对照组（NC）、中等强度组（ME）、大强度组（HE）,进行8周跑台训练。采用ATP酶染色法测定I、Ⅱ型肌纤维,凝胶电泳技术分离肌球蛋白重链（MHC）亚型,比色法测定骨骼肌中CaN活性,免疫印迹技术测定骨骼肌NFATc1蛋白含量。结果：①肌纤维密度变化：股四头肌ME组I、Ⅱ型纤维数密度均显著增加（P<0.05）,HE组仅Ⅱ型纤维面密度显著增加（P<0.05）;比目鱼肌HE、ME组I型纤维数密度均显著增加（P<0.05）;②肌纤维MHC亚型百分比变化：股四头肌ME组MHCI、Ⅱa百分比升高（P<0.05）,而MHCⅡb百分比降低（P<0.05）;比目鱼肌MHCI百分比升高,MHCⅡa、Ⅱb百分比降低;③ME组大鼠CaN活性、NFAT1蛋白含量均显著升高（P<0.05）。结论：大、中等强度运动可诱导骨骼肌MHC快型向慢型转化,同时伴随肌纤维亚型变化骨骼肌中CaN活性增加、NFATc1蛋白表达增加。     

钙调神经磷酸酶信号通路参与钙激动剂介导的心肌细胞肥大

目的在于探讨不同来源的细胞内游离钙(［Ca2+］i）对钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）依赖信号通路和心肌细胞肥大的影响。方法以原代培养的乳鼠心肌细胞为模型,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、雷尼丁（RY）和三磷酸肌醇（IP3）（浓度均为10-7mol／L）激活心肌细胞［Ca2+］i,应用钙荧光指剂Fura-2／AM动态观测心肌细胞［Ca2+］i浓度,同时检测心肌细胞CaN活性及蛋白表达。用氚-亮氨酸（3H-Leu）掺入量测定心肌细胞蛋白质合成速率。结果发现AngⅡ、RY和IP3明显增加心肌细胞［Ca2+］i浓度、CaN活性及蛋白表达并提高3H-Leu的掺入量,与对照组心肌细胞相比差异显著（P＜0．01）。结论激活心肌细胞［Ca2+］i可明显提高心肌细胞蛋白合成速率,心肌细胞CaN活性及蛋白表达似与细胞［Ca2+］i变化有明显关系而与其来源无关,表明CaN信号通路在心肌细胞生长中发挥重要作用。     

槲皮苷:一种抑制钙调蛋白磷酸酶(CN)的新型免疫抑制剂

目的 以钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶,从中草药中寻找高效、低毒的免疫抑制剂.方法 以CN为靶点,筛选并分离能够抑制其活性的天然化合物.在细胞和动物水平评价该化合物的免疫抑制效果及毒副作用,并通过荧光猝灭、分子对接、免疫印迹、双荧光素酶报告基因、实时定量PCR等实验探究天然化合物与CN的作用机理及可能的免疫抑制作用机制....     

钙调神经磷酸酶依赖的信号通路在大鼠心肌肥大中的作用及调节

本工作在大体动物模型、细胞及分子水平上,对钙调神经磷酸酶（CaN)依赖的信号通路在大鼠豳肥大中的作用及其调节机制进行了研究。结果发现;（１）ＣaN信号通路参与血流动力学超负荷、心肌纤维化、旁／自分泌因子等诱导的心肌细胞肥大;（２）ＣaN信号通道参与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及碱性成纤维细胞因子(bFGF)诱导的心肌细胞肥大和AngⅡ及bFGF刺激的心脏成纤维细胞增殖;（３）ＣaN通路与丝裂素活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）信号途径可能存在相互关系;（４）ＣaN的活化依赖胞内Ｃa^2 浓度的持续升高,ＣaN的活化还受蛋白激酶磷酸化的调节,ＡngⅡ刺激心肌细胞ＣaNmRNA的表达显著增加,ＣaNmRNA本身的表达受Ｃa^2 信号及ＭＡＰＫ级联反应的调控。结论：Ｃa^2 -ＣaN信号通路介导心肌肥大的发生。     

研究报告：槲皮苷： 一种抑制钙调蛋白磷酸酶（CN）的新型免疫抑制剂

目的以钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶,从中草药中寻找高效、低毒的免疫抑制剂。方法以CN为靶点,筛选并分离能够抑制其活性的天然化合物。在细胞和动物水平评价该化合物的免疫抑制效果及毒副作用,并通过荧光猝灭、分子对接、免疫印迹、双荧光素酶报告基因、实时定量PCR等实验探究天然化合物与CN的作用机理及可能的免疫抑制作用机制。结果槲皮苷在体外和细胞内均能抑制CN的活性,并且能够有效抑制小鼠脾细胞的增殖,缓解小鼠迟发超敏反应。毒理研究结果显示,槲皮苷对实验小鼠无急性毒性,且毒副作用很小。荧光猝灭实验和分子对接分析表明,槲皮苷可能与CN上的两个位点相结合,并通过CN-NFAT通路参与调节免疫反应。结论通过筛选获得了新型CN抑制剂槲皮苷。槲皮苷具有成为新型低毒免疫抑制剂的潜在可能。     

酿酒酵母细胞中钙离子信号传导途径的研究进展

酿酒酵母（SaccharomycescP增v括fdP）细胞可以通过ca2＋／钙调磷酸酶信号途径来应对许多外界环境胁迫。在交配信息素、盐或者其他环境压力存在的条件下,钙离子会通过细胞质膜上的未鉴定的钙转运蛋白x和M或者由Cchl和Midl组成的钙通道进入细胞质。胞质内钙离子浓度的增加会激活细胞质里的钙调磷酸酶（calcineurin）。钙调磷酸酶的一个非常重要的作用是去磷酸化细胞质内的转录因子Crzl,造成它快速地从细胞质转移到细胞核,从而诱导包括液泡膜上钙泵蛋白基因PMCl以及内质网膜和高尔基体膜上钙泵蛋白基因尸脚,在内的目标基因的表达。这两个钙泵蛋白和液泡膜上的Ca2＋／H＋交换蛋白Vcxl一起作用,将细胞质内的钙离子浓度控制在50～200nmol／L的正常生理浓度内．使细胞能够正常生长。该综述主要论述了酿酒酵母细胞内Ca2＋／钙调磷酸酶信号途径的最新研究进展。     

活化T 细胞核因子在皮肤疾病发生与发展中的作用

活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)作为细胞信号转导中的一类重要因子,最早被认为是一种能结合和上调T细胞中IL-2基因启动子的诱导性核因子,现发现它不仅在免疫系统中发挥功能,在肿瘤发生、发展中也起着关键性作用。近年来,越来越多的研究显示NFAT与人类皮肤疾病的发生、发展密切相关。在多种皮肤疾病患者真表皮成分中,NFAT异常表达,促进T细胞活化、表皮细胞增殖及自身免疫反应的形成,甚至促进肿瘤形成和浸润转移。本文旨在阐述研究发现的NFAT在皮肤疾病中发挥的重要作用,涉及T细胞活化、自身免疫反应形成、肿瘤形成及其浸润转移,以及NFAT在皮肤疾病中作用机制,预测这些研究结果对于皮肤病的治疗有着重要意义。     

MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin/NFAT信号通路有关

心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素（phenylephrine, PE）刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶（calcineurin）/活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）的关系.结果显示, 原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调. RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接 影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurin/NFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.     

VEGF increases the proliferative capacity and eNOS/NO levels of endothelial progenitor cells through the calcineurin/NFAT signalling pathway

We have investigated whether VEGF (vascular endothelial growth factor) regulates the proliferative capacity and eNOS (endothelial nitric oxide synthase)/NO (nitric oxide) pathway of EPCs (endothelial progenitor cells) by activating CaN (calcineurin)/NFAT (nuclear factor of activated T-cells) signalling. EPCs were obtained from cultured mononuclear cells isolated from the peripheral blood of healthy adults. Treatment with VEGF (50 ng/ml) potently promoted CaN enzymatic activity, activation of NFAT2, cell proliferation, eNOS protein expression and NO production. Pretreatment with cyclosporin A (10 μg/ml), a pharmacological inhibitor of CaN or 11R-VIVIT, a special inhibitor of NFAT, completely abrogated the aforementioned effects of VEGF treatment and increased apoptosis. The results indicate that VEGF treatment promotes the proliferative capacity of human EPCs by activating CaN/NFAT signalling leading to increased eNOS protein expression and NO production.     

Q134R: Small chemical compound with NFAT inhibitory properties improves behavioral performance and synapse function in mouse models of amyloid pathology

Inhibition of the protein phosphatase calcineurin (CN) ameliorates pathophysiologic and cognitive changes in aging rodents and mice with aging‐related Alzheimer''s disease (AD)‐like pathology. However, concerns over adverse effects have slowed the transition of common CN‐inhibiting drugs to the clinic for the treatment of AD and AD‐related disorders. Targeting substrates of CN, like the nuclear factor of activated T cells (NFATs), has been suggested as an alternative, safer approach to CN inhibitors. However, small chemical inhibitors of NFATs have only rarely been described. Here, we investigate a newly developed neuroprotective hydroxyquinoline derivative (Q134R) that suppresses NFAT signaling, without inhibiting CN activity. Q134R partially inhibited NFAT activity in primary rat astrocytes, but did not prevent CN‐mediated dephosphorylation of a non‐NFAT target, either in vivo, or in vitro. Acute (≤1 week) oral delivery of Q134R to APP/PS1 (12 months old) or wild‐type mice (3–4 months old) infused with oligomeric Aβ peptides led to improved Y maze performance. Chronic (≥3 months) oral delivery of Q134R appeared to be safe, and, in fact, promoted survival in wild‐type (WT) mice when given for many months beyond middle age. Finally, chronic delivery of Q134R to APP/PS1 mice during the early stages of amyloid pathology (i.e., between 6 and 9 months) tended to reduce signs of glial reactivity, prevented the upregulation of astrocytic NFAT4, and ameliorated deficits in synaptic strength and plasticity, without noticeably altering parenchymal Aβ plaque pathology. The results suggest that Q134R is a promising drug for treating AD and aging‐related disorders.