黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】对黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因进行克隆和密码子优化,使其在毕赤酵母(Pichia pastoris X-33)中高效表达。【方法】以黑曲霉基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(Anfae A),并对Anfae A基因进行毕赤酵母密码子偏好性"随机优化"和"一对一优化",全基因合成后分别与表达载体pPICZαA连接,构建表达载体pPICZαA-Anfae A、pPICZαA-op Anfae A I和pPICZαA-op Anfae A II。经Sac I线性化后电转化至P.pastoris X-33中,筛选阳性转化子。摇瓶发酵4.5 d后,测定并比较重组阿魏酸酯酶(re Anfae A)酶活。【结果】密码子优化前阿魏酸酯酶酶活为6.8±0.1 U/m L,基因"一对一优化"和"随机优化"后的重组酶酶活分别为5.2±0.1 U/m L和39.9±0.1 U/m L,"随机优化"后酶活比优化前提高了近6倍,而"一对一优化"后酶活仅为优化前酶活的76.5%。重组阿魏酸酯酶的最适p H为5.5,且在pH 4.5-7.0稳定性较好;最适反应温度50°C,在45-50°C较稳定。【结论】阿魏酸酯酶基因经密码子"随机优化"后进行重组表达,酶活显著提高,对研究阿魏酸酯酶在毕赤酵母及其它宿主中的高效表达具有一定的借鉴意义,也为大规模工业化应用奠定了基础。     

黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA),并对重组酶特性进行表征。【方法】采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408的阿魏酸酯酶A基因。将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae,经线性化后电转化P.pastoris GS115,透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达。利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】成功从A.niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank:KF911349),并实现了其在P.pastoris GS115中的高效表达。该基因长度为783bp,含有1个开放阅读框架(ORF),编码260个氨基酸,Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99%。翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高,酶活达24.72 U/mL,比活力为40.84 U/mg,比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右。重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0,且在pH 4.0-9.0稳定性较好;最适反应温度50℃,在40-60℃时较稳定。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提,也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础。     

嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

毕赤酵母中外源表达脂肪酰-CoA还原酶生产脂肪醇

【目的】通过在毕赤酵母Komagataella pastoris GS115中外源表达来源于霍霍巴[Simmondsia chinensis(Jojoba)]的脂肪酰-Co A还原酶Jojoba FAR,利用微生物发酵生产脂肪醇。【方法】以质粒p RL105为模板PCR扩增获得霍霍巴脂肪酰-Co A还原酶的编码基因,以p GAPZαA为载体构建重组表达质粒p GAP-far,并通过电转化法转入K.pastoris GS115,筛选转化子并发酵,气相色谱-质谱联用检测发酵产物。【结果】构建了毕赤酵母重组菌株p GAPZ-far-GS115,通过摇瓶发酵检测到脂肪醇的合成。随后在7 L规模的发酵罐上发酵验证,得到脂肪醇产量为134.74 mg/L,产率为1.22 mg/(L·h)。【结论】实现了脂肪醇在毕赤酵母中的生物合成,为工业上利用毕赤酵母生产脂肪醇奠定了一定基础。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

腺苷酸脱氨酶在乳酸克鲁维酵母中构建表达

【目的】实现鼠灰链霉菌来源经密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)中组成型表达。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶(AMP)基因经密码子优化后作为模板,设计特异性引物,PCR扩增AMP脱氨酶基因opt-AMPD,以p KLAC1为载体构建重组表达质粒p KLAC1-opt-AMPD,经Sac II线性化后电转化法转入K.lactis GG799,筛选得到重组菌株,测定酶活,经His TrapTM HP纯化后得到AMP脱氨酶,并优化重组菌的发酵培养基。【结果】对AMP脱氨酶基因进行了密码子优化后,构建了重组K.lactis GG799/p KLAC1-opt-AMPD,实现组成型表达,密码子优化后AMP脱氨酶酶活提高到586±50 U/m L。SDS-PAGE结果显示,纯化后的AMP脱氨酶为单一条带,蛋白大小约为60 k D。优化的发酵培养基为(g/L):葡萄糖40、蛋白胨20、酵母粉15、Na Cl 8、KCl 10、Mg SO4 2,30°C、200 r/min发酵120 h,酶活达到2 100±60 U/m L。【结论】实现了密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799内的组成型表达,为实现腺苷酸脱氨酶的重组高效表达和发酵生产进行了有益探索。     

基因拷贝数对重组毕赤酵母产谷氨酰胺转胺酶的影响

基于毕赤酵母核糖体DNA序列 (rDNA),构建多拷贝谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pPICZα-rDNA- mtg,并转化到表达前导肽 (Pro peptide或pro) 的宿主菌pGAP9-pro/GS115,得到共表达菌株pro/rDNA-mtg (GS115)。实时荧光定量PCR (qPCR) 分析了4株阳性表达菌株中mtg基因拷贝数,进一步研究了不同基因拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响及高产菌株在3 L发酵罐高密度发酵。结果表明,被检测的4株阳性表达菌株中mtg拷贝数分别为2.21、3.36、5.72和7.62 (mtg-2c、mtg-3c、mtg-6c和mtg-8c),其发酵产酶能力和蛋白质表达水平为mtg-3c>mtg-2c>mtg-6c>mtg-8c;高密度发酵较低和较高拷贝数的两株菌mtg-3c和mtg-6c,发酵上清的最高酶活和单位菌体酶活分别为3.12 U/mL、52.1 U/g湿重和2.07 U/mL、36.5 U/g湿重,其中单位菌体酶活mtg-3c是mtg-6c的1.4倍;mtg-3c纯化酶的最高酶活达到7.21 U/mL,蛋白浓度为437.2 μg /mL。通过分析拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响,发现mtg-3c适合pro/rDNA-mtg中pro和mtg共表达,MTG高酶活与菌株较高分泌蛋白有关。     

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P．pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P．pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P．pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P．pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P．pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示：组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg／L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70％,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86％。CAM分析和抗癌实验结果显示：P．pastortis GS115(pGA．P9K-S)和P．pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL／6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90．61％和90．54％。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P．pastoris中表达AS及其他外源蛋白。     

Intracellular expression and purification of the Canstatin-N protein in Pichia pastoris

Canstatin-N DNA fragment amplified from human genome was inserted into the MCS of pGAP9K*, an intracellular expression vector of Pichia pastoris, to generate pGAP9K*-can-N which was then transformed into P. pastoris GS115 by electroporation. A transformant was chosen as an engineering strain from the plate containing G418 (700 μg/ml). D-sorbitol was selected as the only carbon source. The fermentation was carried out in a 50 L bioreactor at a 20 L working volume. After 48 h fermentation with continuous feeding of 25% (w/v) D-sorbitol and 0.8% PTM4, the cell grew to A(600)=178 and intracellularly expressed Canstatin-N reached 780 mg/L. Snail enzyme was combined with water to crack P. pastoris and to release intracellular proteins. The purified recombinant Canstatin-N inhibited CAM angiogenesis and induced significant apoptosis of the human umbilical vein endothelial cell (EVC340).     

黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响

比较黑曲霉脂肪酶与黑曲霉酯酶的3-D结构发现二者在盖子结构域存在显著差异。根据已解析的酯酶的3-D结构信息,运用重叠延伸PCR技术,对黑曲霉脂肪酶的4个位点进行突变,以期获得开盖型黑曲霉脂肪酶。4个突变位点分别为形成黑曲霉脂肪酶盖子结构的α-螺旋与酯酶对应区域的α-螺旋相互置换;Ser84突变为Gly;Asp99突变为Pro;Lys108突变为Glu。4个重组质粒导入毕赤酵母GS115菌株进行异源表达后,仅pPCI9K-anl-D99P和pPCI9K-anl-K108E实现了活性表达。     

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达cbhⅡ基因

用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的重组蛋白CBHⅡ达到50 mg/L。用CMC酶活法测定发酵液中的CMC酶活力为2.05 U/mL。     

毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法

【目的】获得组成型表达脂肪酶毕赤酵母,建立利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。【方法】运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。【结果】重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因。【结论】该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。     

产外切葡聚糖酶真菌的筛选鉴定及毕赤酵母中的表达

【目的】外切葡聚糖酶是纤维素酶组分中一类对结晶纤维素有降解作用的酶类,如何提高外切葡聚糖酶活力是研究的关键问题。【方法】从筛选鉴定得到的一株产外切葡聚糖酶酶活较高的黑曲霉Asp-524菌株出发,通过PCR技术克隆得到外切葡聚糖酶基因序列,生物学信息分析后,构建了毕赤酵母诱导型表达载体,实现了该基因在毕赤酵母中的成功表达。【结果】抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导5 d后,酶活达到4.74 U/mL。酶学性质分析显示重组外切葡聚糖酶最适pH为5.0,pH稳定性分析显示在pH为4.0-6.0范围内相对稳定,酶活能保持在最高酶活力的80%以上,最适反应温度为50°C,经60°C保温1 h后,酶活仍能保持80%以上。【结论】结果说明该外切葡聚糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,这一研究为纤维素酶的实际应用奠定了一定基础。     

碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中成功表达。本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27%。再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL。随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL。该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。