甜叶菊中新KAH基因的克隆及表达模式分析

为进一步揭示甜菊糖苷生物合成途径的分子调控机制,探究甜菊糖苷在甜叶菊叶片中积累差异原因。从不同甜叶菊材料中分别克隆关键分支点酶KAH的编码基因,并对获得的核苷酸序列进行生物学功能分析和预测。结果显示,最终共获得6条高度同源的核苷酸序列,个别关键碱基的突变造成序列开放读码框位置和大小的显著差异,共预测获得7个不同KAH编码基因。KAH1、KAH2同时存在于SR1、SR3、鑫丰3号、谱星1号和守田3号中,KAH3存在于江甜1号和守田3号中,KAH4存在于江甜3号中,KAH5、KAH6、KAH7均存在于SR2中且Sr KAHs在甜菊糖苷积累多的品种和组织部位中表达更高。7个KAH基因均含有P450保守结构域且均属于CYP716家族成员;亚细胞定位预测KAH2和KAH4定位于细胞质其他5个均定位在叶绿体中。甜叶菊中KAH编码基因的数目、氨基酸长度及在亚细胞结构的定位差异或许是导致甜叶菊不同品种和组织中Sr KAHs表达和功能差异的主要原因并最终糖苷的积累差异。     

甜菊醇糖苷生物合成关键基因的导入和鉴定分析

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）生产的甜菊醇糖苷因具有高甜度、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点,被誉为最有发展前途的新糖源。从甜叶菊叶片克隆了甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1,构建植物基因过量表达载体,以单独或组合的形式将这些基因导入到甜叶菊中,获得转基因植株。与野生型对照植株相比,单独导入SrUGT85C2的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量提高,总糖苷、莱包迪苷A含量及占比没有明显变化;单独导入SrUGT91D2m的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量显著降低,而甜菊醇双糖苷含量显著增加;单独导入SrUGT76G1的转基因植株中,总糖苷含量显著提高,莱包迪苷A含量达到10%以上,比对照提高了2倍,而甜菊糖苷含量减少了一半。3个基因组合同时导入的转基因甜叶菊植株与单独导入SrUGT76G1的转基因甜叶菊植株类似,其总糖苷、莱包迪苷A含量及其占比均显著提高。这些结果为以后通过分子生物学技术来调控甜菊醇糖苷生物合成关键基因的表达,培育莱包迪苷A含量高的高品质甜叶菊新品系提供了理论依据和技术方法。     

鸡细胞色素P450 1A5的原核表达与活性重组

旨在对鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)蛋白进行体外功能研究,采用大肠杆菌系统进行CYP1A5的异源表达。以鸡的cDNA为模板,扩增出CYP1A5基因,将该基因的N端编码区进行修饰,并连接到pCW载体中构建His-CYP1A5,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达。经CO-差示光谱检测,所获得的His-CYP1A5具有典型的P450吸收峰。该蛋白与细胞色素P450还原酶(CPR)进行体外重组,构成的重组酶系表现出乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶活性。结果表明,所采用的表达策略可以成功产生出具有催化活性的鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)蛋白。     

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE21的克隆、表达分析及亚细胞定位

信号失活是嗅觉动态过程的一个重要步骤, 这一过程涉及多样的气味降解酶类。本研究利用RT-PCR方法从家蚕Bombyx mori雄蛾的触角中克隆了一个细胞色素P450基因CYP6AE21。该基因含有一个1 572 bp的开放阅读框（open reading frame, ORF）, 编码523个氨基酸, 预测分子量为60.5 kD, 等电点为8.4, 含有细胞色素P450的特征序列血红素结合位点区域。CYP6AE21和CYP6AE2基因一样在相同位置含有1个内含子序列, 且相应的2个外显子大小相同。两者的核苷酸序列相似性达到94.5%, 且在基因组上以头尾相连的方式成簇排列, 中间由约7.6 kb核苷酸序列隔开。CYP6AE21在幼虫的头部和脂肪体, 以及雄蛾和雌蛾的触角中表达量较高; 在幼虫的其他组织和蛾的多个组织中也有一定的表达。P450酶系的重要组分之一--NADPH细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase, CPR）基因也在雌蛾和雄蛾触角中高水平表达, 而在其他组织中表达量相对较低。亚细胞定位分析表明CYP6AE21表达产物定位于细胞质中。推测CYP6AE21和CYP6AE2是由其中一个基因加倍复制形成的; 此P450的功能之一可能是参与内化进细胞的气味分子的降解清除。     

丹参香豆酸-3-羟化酶基因(SmC3H)的生物信息学及其组织表达模式分析

通过分析丹参转录组数据库(SRX021907)得到一条香豆酸-3-羟化酶(C3H)基因,blast比对发现该基因为丹参C3H(EU358957.1),该基因c DNA全长1 704 bp,包括1个1 503 bp的开放阅读框,编码508个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白的分子量为57.21 k D,等电点为8.53,含琢-螺旋,延伸链和无规则卷曲,具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。聚类分析表明其与芝麻的亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,该基因在茎中的表达量最丰富,其次是叶和花,根中最低。     

基因组分析揭示拟茎点霉XP-8产松脂醇及其糖苷等多种次级代谢产物的合成途径

【目的】通过解析拟茎点霉属XP-8的基因组序列信息,揭示该菌株潜在的代谢途径,并分析松脂醇及其糖苷化合物等次级代谢产物生物合成相关的关键基因。【方法】使用Illumina Hi Seq 2500高通量测序平台对拟茎点霉XP-8菌株进行全基因组测序,并通过不同软件对测序数据进行序列拼接,基因预测与功能注释。【结果】组装后的拟茎点霉XP-8基因组大小为55.2 Mb,GC含量53.5%,含有17094个蛋白编码基因和310个非编码基因。获得了松脂醇及其糖苷化合物等次级代谢产物生物合成相关的基因。系统发育分析揭示出拟茎点霉XP-8与5种子囊菌共有12635个同源基因和5626个基因家族。【结论】拟茎点霉XP-8具有用于合成松脂醇及其糖苷化合物等多种次级代谢物的基因组基础,为下一步的代谢工程改造提供依据。     

构建酿酒酵母细胞工厂高效合成摩尔酸

[目的] 摩尔酸作为齐墩果烷型三萜化合物具有抗HIV、抗炎等多种生物学活性,其前体物质是计曼尼醇,本研究基于合成生物学策略构建酿酒酵母细胞工厂高效合成摩尔酸。[方法] 运用CRISPR/Cas9技术,首先分别整合不同来源的氧化鲨烯环化酶（OSCs）,筛选高产计曼尼醇底盘细胞;进一步异源表达长春花来源的细胞色素P450氧化酶（CYP716AL1）和麻风树来源的细胞色素P450还原酶（JcCPR）,构建摩尔酸生物合成途径;并通过CYP716AL1和不同来源的CPR适配研究以及过表达甲羟戊酸（MVA）代谢途径中关键酶的方式提高摩尔酸的产量。[结果] 整合苹果来源的氧化鲨烯环化酶MdOSC获得的重组菌株计曼尼醇产量最高,达68.3 mg/L;以此为底盘细胞进一步整合CYP716AL1和JcCPR实现了摩尔酸的生物合成,产量为15.0 mg/L;共表达CYP716AL1和拟南芥来源的CPR获得的重组菌株摩尔酸产量最高,达到24.3 mg/L;最后过表达MVA代谢途径中的关键酶法呢基焦磷酸合酶（ERG20）和鲨烯环氧酶（ERG1）,获得的重组菌株摩尔酸产量高达34.1 mg/L。[结论] 本研究实现了摩尔酸的高效生物合成,为构建高产齐墩果烷型三萜酿酒酵母细胞工厂提供了理论和技术依据。     

细胞色素P450在植物三萜和甾醇骨架修饰中的功能研究进展

植物三萜类化合物在植物生长发育、抵御逆境胁迫与病虫害、生物间相互作用以及传递信息等方面发挥重要作用,植物甾醇具有重要的药用价值.细胞色素P450单加氧酶(CYP450)是参与植物代谢的最大酶家族,在三萜及甾醇骨架结构多样化及功能化修饰中具有关键作用.到目前为止,研究发现约有80个CYP450参与植物三萜代谢,包括亚家族CYP51H, CYP71A, D, CYP72A, CYP81Q, CYP87D, CYP88D, L, CYP93E, CYP705A, CYP708A和CYP716A, C, E, S, U, Y,它们参与包括特定病原体的化学防御功能和药理活性的三萜及其皂苷类化合物的代谢.亚家族CYP51G, CYP85A, CYP90B-D, CYP710A, CYP724B和CYP734A与甾醇和类固醇激素的生物合成有关.本文针对CYP450基因在三萜及甾醇化合物形成过程中不同位点的修饰功能进行概述,重点探讨了陆地植物CYP450基因11个家族的进化及在双子叶、单子叶植物中五环三萜物质合成过程中的功能.以期为充分利用具有重要价值的抗肿瘤、抗艾滋病的三萜物质的合成生物学的研究及其代谢调控提供进一步的理论依据.     

棉蚜细胞色素P450 CYP6J1的克隆与表达

为了深入了解细胞色素P450 CYP6J1蛋白的结构和功能,本实验克隆获得了棉蚜Aphis gossypii P450CYP6J1基因,对该基因进行信息学及原核表达分析,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达结果,并用Western-blot进行验证。结果表明,P450 CYP6J1序列长1 398 bp,编码氨基酸数为465,理论分子量为53.67 k D,理论等电点为8.80。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。同源性分析表明,棉蚜c DNA序列推导的氨基酸与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的保守性最为接近,一致性可达92%。在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得的His-CYP6J1蛋白,并用Western-blot检测目的蛋白大小正确。这些研究结果为棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体制备提供了基础。     

飞蝗CYP408B1和CYP409A1基因的原核表达

【目的】细胞色素P450是分布极其广泛的超家族酶,在昆虫内源及外源化合物代谢中发挥着重要的作用。本文分析了飞蝗Locusta migratoria CYP408B1和CYP409A1基因在不同组织部位的表达差异,并对两种蛋白进行原核表达,为其分子特性和生物学功能的深入研究提供基础资料。【方法】提取飞蝗5龄若虫不同组织部位的总RNA,体外反转录成c DNA,采用Real-time PCR和RT-PCR技术分析飞蝗CYP408B1和CYP409A1在不同组织部位的表达模式,构建表达载体p CW/CYP408B1、p CW/CYP409A1和p AC/CPR,将p CW/CYP408B1和p CW/CYP409A1分别与p AC/CPR在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行共表达。【结果】通过PCR检测,发现CYP408B1和CYP409A1在飞蝗5龄若虫触角、脑、视叶、咽下神经节、胸神经节和附腺中均有表达,其中CYP408B1在附腺中表达量较高。原核表达结果显示,CYP409A1和CPR(NADPH细胞色素P450还原酶)均可表达,蛋白分子量分别约为58 ku和77 ku,但均为包涵体,而CYP408B1未能成功表达。【结论】本文揭示了飞蝗CYP408B1和CYP409A1在不同组织部位的表达模式,并对CYP409A1和CPR进行了原核表达,研究结果为深入探讨飞蝗细胞色素P450基因对杀虫剂的代谢解毒作用提供了实验依据和基础资料。