几种玉米基因转移技术的研究及转基因植株的获得

用基因枪、超声波和子房注射法转化玉米,所用质粒pB48．415带有3’端截短的Bt毒蛋白基因和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因。用基因枪轰击玉米胚性愈伤组织和幼胚,超声波处理玉米胚性愈伤组织,用自制的微玻针注射授粉后l0～20h的玉米子房,均已成功地获得了转Bt基因的玉米檀株．点杂交和Southern吸印杂交的结果都证明在转基因玉米檀株中存在Bt毒蛋白基因。     

小麦花粉管通道及子房注射法转化Anti-TrxS基因

为了获得抗穗发芽转基因小麦材料,以13个小麦品种(品系)为受体材料,用花粉管通道及子房注射法进行了硫氧还蛋白反义基因(Anti-TrxS)的遗传转化。花粉管通道法共转化小花2036朵,收获T0代种子1616粒,结实率为79．4％,将T0代种子大田点播,获T1代苗1424株,出苗率为88．1％。对T1代株系叶片基因组DNA进行PCR检测,31个株系中有16个株系呈阳性反应。子房注射法共转化小花1206朵,收获种子89粒,结实率为7．4％,T1代共出苗41株,出苗率为46．1％,对郑新991T1代株系进行PCR检测,电泳结果呈阳性反应。     

金鱼草基因转化和转基因植株再生

本实验采用根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐ３５ＳＧＵＳＩＮＴ与金鱼草下胚轴切段共培养,将ＧＵＳ基因导入金鱼草细胞,通过不定芽发生途径获得抗Ｇ４１８再生植株．经ＤＮＡ／ＤＮＡ斑点杂交及ＧＵＳ活性原位组织检测初步证实外源基因ＧＵＳ已整合进金鱼草基因组并得到表达．     

凤尾丝兰子房离体培养的器官发生及植株再生

用凤尾丝兰(Yucca gloriosa L.)离体子房为外植体接种材料,在附加KT、2,4-D及LH的MS培养基上诱导子房膨胀及愈伤组织发生;在附加6-BA、NAA及LH的MS培养基上诱导大量丛生芽;转至MS附加IBA的培养基上则能诱导根系形成;在间歇性高温灭菌及药物拌土的基质上,移植成活率达72%以上,得到了批量成苗。经镜检,试管苗与原株根蘖苗染色体数目一致。并对培养中各分化阶段进行了过氧化物酶活性测定,发现过氧化物酶活性随分化进展逐渐提高,呈正相关。     

大肠杆菌gutD基因转入玉米及耐盐转基因植株的获得

将大肠杆菌糖醇代谢关键基因——— 6 磷酸山梨醇脱氢酶 ( gutD)基因转入玉米 .Southern和Western吸印杂交的结果证明了外源基因的整合和表达 .用气相色谱法在转基因玉米中检测到山梨醇的合成和积累 .营养液盆栽试验的初步结果表明 ,转基因玉米植株的耐盐性明显高于对照     

用天花粉蛋白基因转化小麦获得转基因植株

取普通小麦品种京411未成熟胚诱导愈伤组织,10天左右,对820个胚性愈伤组织用含有35S启动子的天花粉蛋白（trichosanthin,TCS)基因轰击。2周后,将这些被轰击的愈伤组织转到含潮霉素50mg/L的筛选培养基上,经分化和生根,获得了33棵再生植株,经接饲毒蚜虫抗病性鉴定和PCR,Southern杂交分析,从中筛选出4株含有编码TCS的转基因小麦植株,转化频率为0．49％。     

对生玉米离体培养再生体系的建立

以对生玉米的雌、雄幼穗为外植体,研究了不同质量浓度激素及其组合对愈伤组织诱导、再分化苗和试管苗生根的影响,建立了对生玉米离体培养再生体系。结果表明：长度为15-17 mm的雌、雄幼穗能够诱导出质量较好的愈伤组织,但只有来自于雄幼穗的愈伤组织才能再生成苗。适合愈伤组织诱导的培养基为Ms+1．5-2．0 mg·L-12,4-D+0．5 mg·L-16-BA+0．5 mg·L-1 NAA+500 mg·L-1脯氨酸+1000 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖;适合愈伤组织再分化培养基为MS+1．5-2．0 mg·L-1 6-BA+0．1 mg·L-1 NAA+500 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1 蔗糖;适合试管苗生根培养基为1／2 MS+0．25-0．5 mg·L-1 IBA+20 g·L-1蔗糖。     

玉米耐铝毒基因的分离

以抑制消减杂交（SSH）为手段,以玉米对铝敏感的自交系Mo17和耐铝的自交系TL94B为材料,分别构建它们的正向和反向消减文库,分别筛选获得了124、47、103和64个阳性克隆。对文库的鉴定表明,插入片段分布在0.25-1．0kb之间,阳性克隆率在18％左右。对338个阳性克隆进行测序,得到232种表达序列标签（EST）,其中70．2％的EST可推测其功能。结果表明,玉米的铝离子胁迫反应涉及胁迫因子的信号传导、响应基因的转录表达与调控、物质的合成与运输、细胞结构和功能的改变等。     

Selection of Microspore Derived Embryogenic Structures in Maize Related to Transformation Potential by Microinjection

Microspores are attractive targets for transformation of maize through DNA microinjection since they may allow, through the development of embryogenic structures, the regeneration of transgenic plants without chimerism. Unfortunately, microinjection into unicellular microspores is technically difficult because of the presence of the exine. However, in later stages of development, this difficulty may be overcome. In this regard, our objective was to determine the most suitable stages of early androgenic development for microinjection using lucifer yellow as a marker dye. Experiments have shown that the fluorescent dye is able to spread inside the whole embryogenic structure (about 4–10 days old), only in those cases where internal cell walls are still absent or incompletely formed, as assessed by cytological observations. At later stages, when the septation is completed and the embryo is cellularized, diffusion of the dye is no longer possible. These results demonstrate that multinuclear structures with the broken exine and a cytoplasm not yet partitioned, may be conveniently used for direct transformation via microinjection.     

玉米花粉体外萌发方法改进及其对花粉介导转基因的作用

超声波处理花粉介导植物基因转化方法由山西省农业科学院生物技术研究中心发明, 已被国家知识产权局授予发明专利(专利号ZL 99121152.9)。在该专利的基础上, 针对玉米(Zea mays)花粉取样、保存和处理条件等因素对其体外萌发的影响进行深入研究, 提出了改进玉米花粉体外萌发实验的方法。研究结果表明, 在不同时期对开花的玉米进行花粉培养时所需蔗糖溶液的浓度不同; 确定了玉米花粉的保存时间、条件及其对超声波处理后花粉萌发率的影响, 以提高该转化方法中花粉的活力, 并进一步验证了该转基因方法的可靠性; 讨论了玉米花粉体外萌发的操作技巧和各因子的参数, 对提高花粉介导植物基因转化效率有一定的参考价值。     

转水稻NibT基因玉米植株的获得及抗病性研究

以玉米(Zea mays L.)自交系'金黄96B'为受体材料,供体为质粒pWM101并携带有水稻矮缩病病毒复制酶基因Nib的提前终止突变体基因NibT,采用超声波处理花粉介导植物基因转化方法将NibT基因导入受体,经PCR检测和Southern杂交分析证实获得转基因植株,进而对T1～T3代转基因植株(株系)进行分子分析、田间抗病鉴定和农艺性状调查.逐代分子检测分析结果证明,目的基因可稳定遗传.抗病鉴定结果证明转基因植株(株系)各代抗病水平基本一致,抗病性比对照提高3级.农艺性状调查分析表明,与对照比较,转基因植株株高增加7～18 cm、穗位高增高0～13 cm、穗长增加0.7～2.1 cm、穗粒数多8～35粒、百粒重增加1.1～2.6 g,转基因株系与阴性对照间、各代转基因株系相互间都差异显著(P＜0.05);调查还发现转基因植株的株高和穗位高随着世代的增加,与对照间的差异逐代减少.研究也说明,超声波处理花粉介导植物基因转化方法是一种简捷、快速和有效的植物转化工具.     

玉米叶形相关性状的Meta-QTL及候选基因分析

叶长、叶宽、叶面积及叶夹角不仅影响玉米(Zea mays)光合效率, 也是株型的重要构成因素。通过对620个叶形QTL进行整合, 构建不同遗传背景下的叶形QTL整合图谱, 利用元分析发掘出22个叶长、22个叶宽、12个叶面积以及17个叶夹角mQTL; 进一步运用生物信息学手段, 确定44个与叶片发育密切相关的候选基因。分析发现, 仅有NAL7-like、YABBY6- like和GRF2等13个基因位于mQTL区间内, 而玉米中已克隆的KNOTTED1、AN3/GIF1、rgd1/lbl1、mwp1及SRL2-like、HYL1-like和CYCB2;4-like等水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶形同源基因位于未被整合的QTL内; 对44个候选基因在叶片长、宽、厚发育过程中基部-末端、中央-边缘、远轴-近轴的调控机理进行归纳分析, 发现玉米中仅有少数几个候选基因被报道, 揭示了叶形发育的部分分子机理。因此, 对玉米叶形相关mQTL/QTL及基因进行全面深入的分析, 不仅有助于增加对其遗传结构的了解, 发掘更多候选基因, 阐明叶形发育和形成的分子机制, 还可为耐密理想株型的分子标记辅助选择提供依据。     

玉米CMS分子生物学研究进展

本文对玉米CMS研究已获得的、并为普遍接受的分子生物学研究结果进行了粗略总结;对近年来在玉米细胞质雄性不育育性相关核基因的分子标记定位、克隆及辅助选择,育性相关胞质基因的克隆与表达方面的研究进展进行了简要概述;我们认为在今后一段时期,玉米CMS研究将着重围绕核不育基因的克隆及表达模式、线粒体功能基因组、育性相关胞质基因与核育性基因相互作用等方向进行研究,以期阐述玉米CMS的形成机理。 Progress of Molecular Biology of CMS in Maize ZHANG Zu-xin,ZHANG Fang-dong,ZHENG Yong-lian National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China Abstract:In the paper,we have summarized the molecular biological accomplishment acquired and accepted by most of maize researchers on CMS of maize.A brief review of current molecular biological progress of CMS of maize are displayed in the paper.These progresses concern in the positioning,cloning and maker-assisted selection of nucleic genes associated with fertility,expression and cloning of cytoplasmic genes associated with male sterility,In order to elucidate the molecular mechanism of CMS of maize,the areas about cloning and expression profiling of male sterile nucleic genes,and functional genomics of mitochondria,and interaction cytoplasmic genes with nucleic genes will need to be researched in the future. Key words：maize(Zea mays L.);CMS;mtDNA;gene associated with fertility     

农杆菌介导的玉米原位转化方法改良

原位转化是一种简便的植物转基因方法,在拟南芥中已经应用较为成熟,在玉米上的应用并不多见.本文在玉米开花期间,将含有目标载体pCAMBIA1301的农杆菌菌株LBA4404的细胞悬浮液直接涂抹到事先授粉约8小时后并去除掉苞叶和花丝的幼穗上.转化后种子的幼苗,经过gus活性染色和潮霉素基因(hpt)的PCR扩增,证实有部分的种子T-DNA整合进入了基因组.在潮霉素筛选后,有2.6 %抗性苗存活.其中57.7 %抗性植株表现出GUS阳性,相当于全部检测幼苗的1.5 %.这一结果通过潮霉素基因的PCR扩增,得到进一步的证实.     

Changes in Growth and Nitrogen Assimilation in Maize Plants Induced by NaCl and Growth Regulators

Experiments were conducted to determine the interactive effects of salinity and certain growth regulators on growth and nitrogen assimilation in maize (Zea mays L. cv. GS-2). 100 mM NaCl inhibited the biomass accumulation, chlorophyll and carotenoid contents in leaves, nitrate content and uptake and nitrate reductase activity. The application of kinetin, ascorbic acid and 10 and 50 μM abscisic acid in the first experiment and 50 and 100 μM abscisic acid in the second experiment induced a substantial increase in the above parameters, the effect was highest with abscisic acid in salinized as well as non-salinized plants. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.