在枯草杆菌中产生乙型肝炎核抗原和口蹄疫病毒的主要抗原

虽然大肠杆菌普遍地用来作为已克隆基因表达的寄主,可是用其它的细菌,如枯草杆菌,来制造病毒或真核生物的多肽,可能是有好处。枯草杆菌是一个非致病的革兰氏阳性细菌。它不像大肠杆菌那样产生内毒素,并还能大量地分泌几个胞外蛋白。在商业上需氧芽孢杆菌的菌株被广泛地用来生产酶和抗菌素。在日本,枯草杆菌(纳豆)被用作食品的一种来源供人们消费。现有的大量培养枯草杆菌的方法,以及从其培养液中分     

克隆的口蹄疫病毒蛋白疫苗——在牛和猪体内的反应

从口蹄疫病毒A_(12)的病毒粒子RNA中制取得到编码其致免疫的衣壳蛋白VP_3的DNA序列,并把它接到质粒上,通过大肠杆菌色氨酸起动—操纵系统表达出一个嵌合蛋白。当被这个质粒转化的大肠杆菌在无色氨酸培养基上生长时,全部细胞蛋白中有大约17％是不溶性的,稳定嵌合蛋白。纯化的嵌合蛋白与口蹄疫病毒的VP_3蛋白等克分子地竞争抗口蹄病毒的特异性抗体。给六头牛、二头猪接种这种蛋白能诱发出高水平的中和抗体和抗口蹄疫病毒侵袭的保护反应。     

SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)基因,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b和pBV222上,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性,可用于抗SARS抗体检测及亚单位疫苗研究。     

水稻草矮病毒核衣壳蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国也有分布[1].其病原是水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV),为纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组RNA组成[2].基因组含六个ssRNA片段,均为双义编码[3,4],其中RNA5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NCP)[3].本文报道应用RT-PCR技术获得RGSV沙县分离株(RGSV-SX)NCP基因的cDNA克隆,并得到其在大肠杆菌中的表达产物.     

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGⅡ4、GGⅡ1和GGⅡ3等为主要的流行遗传型.为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成.以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGⅡ1、GGⅡ3、GGH4和GGⅡ7型衣壳蛋白基因进行了表达.结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒.重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰.这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础.     

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGII4、GGII1和GGII3等为主要的流行遗传型。为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成。以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型衣壳蛋白基因进行了表达。结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒。重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰。这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础。     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白     

地衣形芽孢杆菌热稳定α淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

利用λ噬菌体作为运载体,在大肠杆菌中从直接鸟枪法分离出编码地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶的基因。将含有α-淀粉酶基因的片段再克隆进pBR322,并测定了它的限制性图谱。头肠杆菌克隆子所产生的α-淀粉酶保留了地衣形芽孢杆菌酶的热稳定性。检定了在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中这二基因产物的表达及性质。     

我国病毒基因工程研究进展——λ基因在大肠杆菌中获得功能表达

中国科学院微生物研究所范云六等已建成了带有λ DNA或复制区的重组质粒即pAGS和pAG82,pAG 5在大肠杆菌(C600PoIAts)中无性繁殖,pAG82不仅在大肠杆菌中进行无性繁殖,而且得到功能表达。中国科学院细胞生物研究所匡达人等     

水稻草矮病毒NS6基因在大肠杆菌中的表达及植物表达载体的构建

Large amount of disease-specific protein(SP) accumulated in the rice plant cells infected by rice grassy stunt virus(RGSV). It was deduced that the protein was encoded by NS6 gene on genomic vRNA6 and thus referred to as NS6 protein.But its function is unknown. In an effort to prove the above deduction and to elucidate the function of NS6 protein of RGSV, we constructed a bacterial expression plasmid pGTNS6 producing a fusion protein of glutathione S-transferase (GST) and NS6 protein, and a plant expression vector pCBTNSv6 containing NS6 gene. A recombinant plasmid pTNSv 6 containing the coding region of NS6 gene and the non-coding region at its 5' terminus, cloned by RT-PCR from purified RNAs of Shaxian isolate of RGSV, was used as the start point. Western blot analysis showed that the fusion protein reacted strongly with antisera raised against RGSV-SP, which served as evidence of the deduction.EHA105 of Agrobacterium tumefasciens containing pCBTNSv6 has been obtained and the transformation of rice is underway.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 弱毒株膜蛋白（ Ｍ） 和核衣壳（ Ｎ） 蛋白基因为模板,设计的一对含有 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ 和 Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切位点的引物,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增出一约９００ ｂｐ 的 Ｍ Ｎ 基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ ,构建成重组质粒ｐ Ｂ Ｖ Ｍ Ｎ,导入大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α,经温敏诱导,成功地表达了 Ｍ Ｎ 基因。表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 印迹分析,其分子量约３４ ｋ Ｄ,与兔抗 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 高免血清发生反应,经光密度扫描分析,表达产物量占菌体总蛋白的１２ ％ 。该研究为 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ 基因诊断抗原的研制奠定了基础     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Y病毒普通系(PVY0)的外壳蛋白基因克隆到表达质粒pMAL-c2中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体pMAL-c2-PVY0CP.SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明,这一表达栽体在E.coli DH5α中经IPTG诱导可表达分子量为71.8kDa的特异性融合蛋白.以amylose resin亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为1:1024的特异性抗血清.用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Western blotting对PVY进行检测.     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Ｙ病毒普通系（ＰＶＹ０）的外壳蛋白基因克隆到表达质粒ｐＭＡＬｃ２中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体ｐＭＡＬｃ２ＰＶＹ０ＣＰ。ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测结果表明,这一表达栽体在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中经ＩＰＴＧ诱导可表达分子量为７１．８ｋＤａ的特异性融合蛋白。以ａｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为１∶１０２４的特异性抗血清。用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ对ＰＶＹ进行检测     

人呼吸道合胞病毒F蛋白在大肠杆菌中的表达与免疫效果研究

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,hRSV)是婴幼儿和老年人发生严重呼吸道疾病的主要病因,自上世纪50年代hRSV被发现以来,科学家对hRSV疫苗进行了大量的实验探索,但至今没有上市的疫苗。本研究应用pET32a质粒在大肠杆菌BL21中表达并纯化了hRSV F蛋白(RBF),透射电镜下RBF以三聚体的形式存在(长约20 nm的棒状结构),与5C4抗体(识别抗原表位?)亲和常数为1.26×10^-9。混合铝佐剂肌肉注射免疫BALB/c小鼠,不同剂量(2.5μg、5μg和10μg)的RBF蛋白免疫效果无显著差异(P>0.05),均能诱导小鼠产生高滴度的中和抗体(滴度可达2⁷),并且可以显著降低肺脏病毒滴度,减少肺脏的病理损伤(P<0.001)。与福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)相比,RBF诱导产生偏向Th1类的细胞和体液免疫应答。RBF在动物实验中显示出良好的保护效果,同时原核表达系统具有产量和成本上的优势,因此可以作为预防人感染hRSV的潜在候选疫苗。     

H3N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得H3N2亚型禽流感病毒核蛋白(NP)全长基因,并在大肠杆菌中表达,以用于对NP功能的研究。方法:从感染了H3N2亚型禽流感病毒的MDCK细胞培养液中收获病毒,提取病毒RNA,用RT-PCR扩增出NP基因的编码区序列,将其定向克隆到pTIG-TRX原核表达载体并测序,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。结果:所克隆的核苷酸片段包含了NP基因编码区完整阅读框架,编码498个氨基酸;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达出相对分子质量约66000的重组蛋白。结论:克隆和表达了禽流感病毒核蛋白编码区基因,为获得大量NP以制备抗体,以及对其进行功能性研究奠定了基础。     

昆虫病毒多角体蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

将含有大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白基因(ocu)的BamHl一H片段克隆到表达载体pDR 540的BamiHl位点,得到能抗高浓度氨苄青霉素(200μg／ml)的两个阳性重组体,其胞外总蛋白比亲本质粒高1．1-1．4倍。在大肠杆菌细胞中,BsNPV ocu基因在原核杂合启动子tac驱动下能高水平的表达,表达量达到0．8和4．7mg／ml。免疫沉淀反应证明,表达蛋白为BsNPV的包涵体蛋白,凝胶过摅法测定的平均分子量为32.1×103道尔顿。     

小菜粉蝶颗粒体病毒颗粒体蛋白基因的序列测定及在大肠杆菌中的表达

根据颗粒体病毒颗粒体蛋白(Granulin)基因在其起始密码子上游的12个碱基高度保守序列(TATAAGGAATTT)以及大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)的颗粒体蛋白基因的序列[1]设计引物,PCR扩增得到850bp左右大小的片段,核苷酸序列测定结果表明该病毒的granulin基因全长为855bp,起始密码位于第38~40位碱基,终止密码位于779~781位碱基,编码框序列全长为744;推测该基因编码一段由247个氨基酸组成的多肽,分子质量约为2.9178×104道尔顿。与其它颗粒体病毒颗粒体蛋白基因进行同源性比较,核苷酸同源性都在70%以上,氨基酸同源性都在75%以上,最高的为大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),核苷酸同源性为97%,氨基酸同源性为98%。构建了重组表达载体pet-28a-Gran,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测,表明获得了颗粒体蛋白基因在大肠杆菌BL21中的特异表达。     

PTHrP受体胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白,Parathyroid hormone related protein)与多种肿瘤的生物学行为有关,尤其对肿瘤的骨转移起重要作用。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常值得研究的课题。从肾癌组织中提取RNA,采用逆转录PCR (RT-PCR)方法获得PTHrP受体N端胞外区543碱基对的带信号肽的cDNA片段。将其核苷酸序列与国外发表的资料相比,基因中第262位核苷酸由T变为C,相应密码子由TAC变为CAC,导致氨基酸变异,即由酪氨酸变为组氨酸。将获得的受体基因克隆到原核表达载体pET-3a,在大肠杆菌得到高效表达,经ELISA证实表达产物可与PTHrP特异性结合。体外生物学活性检测表明表达产物可阻断PTHrP的生物学活性。     

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

小菜粉蝶颗粒体病毒颗粒体蛋白基因的序列测定及在大肠杆菌中的表达

根据颗粒体病毒颗粒体蛋白(Granulin)基因在其起始密码子上游的12个碱基高度保守序列(TATAAGGAATTT)以及大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)的颗粒体蛋白基因的序列[1]设计引物,PCR扩增得到850bp左右大小的片段,核苷酸序列测定结果表明该病毒的granulin基因全长为855bp,起始密码位于第38～40位碱基,终止密码位于779～781位碱基,编码框序列全长为744;推测该基因编码一段由247个氨基酸组成的多肽,分子质量约为2.9178×104道尔顿.与其它颗粒体病毒颗粒体蛋白基因进行同源性比较,核苷酸同源性都在70%以上,氨基酸同源性都在75%以上,最高的为大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),核苷酸同源性为97%,氨基酸同源性为98%.构建了重组表达载体pet-28a-Gran,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测,表明获得了颗粒体蛋白基因在大肠杆菌BL21中的特异表达.