小桐子低温胁迫下microRNA实时荧光定量PCR内参的筛选与比较

选择合适的内参对实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果的准确性极其重要,在microRNA(miRNA)的qRT-PCR分析中尤为如此。通过筛选适宜分析小桐子低温胁迫下miRNA定量表达的内参,为小桐子及其他物种mi RNA的qRT-PCR分析提供有用的理论参考。基于以前的小RNA-seq结果,以低温处理的小桐子为材料,挑选11个候选内参基因,用实时荧光定量PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,表达最稳定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值为23左右,表达丰度适中;U6的Ct值为10左右,表达丰度高;因此,miR6448可作为小桐子低温胁迫下表达丰度适中的miRNA qRT-PCR的内参基因;U6可作为小桐子低温胁迫下丰度较高的miRNA qRT-PCR的内参基因。     

小菜蛾U6 snRNA基因的克隆及作为miRNA定量表达分析内参基因的评价

【目的】克隆小菜蛾Plutella xylostella (L.)小分子非编码RNA U6的cDNA序列,并评价其是否适合作为定量检测小菜蛾microRNA (miRNA)表达量的内参基因。【方法】本研究采用RT-PCR 克隆获得了小菜蛾4龄幼虫核小RNA(small nuclear RNA, snRNA) U6的cDNA序列,并用定量PCR法检测了U6及8种miRNAs在小菜蛾不同发育阶段及不同杀虫药剂处理后的表达稳定性。【结果】小菜蛾U6的cDNA序列全长 94 bp,与其他昆虫U6的核苷酸序列一致性达98.9%。用geNorm和RefFinder软件分析荧光定量PCR结果表明,U6在小菜蛾卵、1-4龄幼虫、蛹和成虫7个不同发育阶段表达稳定;用马拉硫磷、毒死蜱、辛硫磷、灭多威、呋喃虫酰肼、高效氯氰菊酯、氯虫苯甲酰胺、溴虫腈和Bt 9种不同作用机理的杀虫药剂处理3龄末幼虫48 h,对U6的表达水平无显著影响。【结论】小菜蛾U6表达水平不受不同发育阶段和不同杀虫药剂处理的影响,符合作为内参基因的基本特点,可作为定量PCR法评价小菜蛾miRNA或其他非编码小分子RNA表达水平的内参基因。研究结果为小菜蛾miRNA表达水平的准确定量奠定了基础。     

盐胁迫下大豆根组织定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR已广泛用于基因表达的分析, 适当的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。在大豆(Glycine max)分子生物学研究中, 逆境响应基因和microRNA (miRNA)表达的内参辅助检测基因均有哪些目前尚不清楚。该研究选用不同盐梯度和时间点组合处理的大豆根组织为材料, 对已报道的其它条件下表达相对稳定的内参基因(ACT、ACT2/7、CYP2、ELF1A、ELF1B、F-Box、TUA和UBC2)以及miRNA内参基因(U6、miR1515a、miR1520c、miR1520d、miR171a和miR171b)的表达情况进行了全面检测; 并采用Δ-Ct、Bestkeeper、NormFinder和Genorm四种方法对检测结果进行了综合分析, 发现ELF1B和CYP2适合作为大豆根系盐胁迫响应基因研究的内参基因, miR1515a和U6适合作为盐胁迫下大豆根组织miRNA研究的内参。上述研究结果为大豆盐胁迫响应基因和miRNA表达及其进一步的功能研究奠定了基础。     

非小细胞肺癌组织中mir-483-5p的差异表达

目的:寻找非小细胞肺癌组织中微小RNA(miRNA)表达谱的差异,并鉴定非小细胞肺癌组织与癌旁组织差异表达的miRNA。方法:应用miRNA芯片分别检测非小细胞肺癌组织与癌旁组织的miRNA表达丰度,并比较两者中差异表达的miRNA;挑选mir-483-5p通过荧光定量PCR进行验证。结果:非小细胞肺癌组织与癌旁组织检测的miRNA表达谱存在较大差异。其中,鳞癌组织中有16条miRNA上调,22条miRNA下调;腺癌组织中有40条miRNA上调,51条miRNA下调。对mir-483-5p进行了定量PCR验证,发现其在非小细胞肺癌组织中的表达丰度显著高于癌旁的正常组织。结论:mir-483-5p在非小细胞肺癌组织中高表达。     

猪组织中miR-103实时定量PCR分析时合适内参的确定

定量实时PCR是miRNA表达检测的主要方法之一,而利用合适内参对定量实时PCR数据进行校正处理是确保该方法分析准确性的关键.为了确定猪正常组织中miR-103定量实时PCR检测分析的合适内参,首先采用geNorm算法和扩增效率试验对miR-196、U6 snRNA和总RNA 3个候选内参进行了评价;然后以miR-103的绝对定量结果为对照,比较分析了3个候选内参的校正准确性．结果表明,miR-196的表达稳定性和扩增效率均优于U6 snRNA和总RNA;以miR-196为内参的miR-103相对定量结果同绝对定量结果具有较高的一致性,两者均显示miR-103在猪大脑中高丰度表达,在胃、小脑、小肠、心脏、肝脏和胰脏中适度表达,在肺、脾脏和腿肌中轻度表达.这些结果说明,miR-196可作为猪正常组织中miR-103定量实时PCR相对定量分析的一个合适内参.     

猪流行性腹泻病毒感染PK-15细胞miRNA的差异表达分析

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diahorrea virus,PEDV)对猪肾传代细胞PK-15miRNA表达谱的影响,将PEDV感染PK-15细胞后,提取总RNA,进行高通量测序,构建感染与未感染PEDV的PK-15细胞的miRNA表达谱,并进行差异性分析,对表达差异显著的miRNA进行heatmap聚类分析及GO(Gene ontology,GO)分子功能(Molecular function,MF)分析,选取10个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行了验证。结果发现,显著性差异表达的miRNA有214个,其中175个miRNA表达上调,39个miRNA表达下调。Heatmap聚类分析表明,病毒组绝大部分差异表达的miRNA较对照组表达量上调,少部分下调。GO分析表明,miRNA广泛参与结合、蛋白结合、蛋白激酶活性、转移酶活性、含磷基团转移、磷酸转移酶活性等生物作用。RT-qPCR验证的各miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致。结果表明,猪流行性腹泻病毒感染对PK-15细胞编码的miRNA表达水平有显著影响,从而对进一步研究治疗PEDV的miRNA制剂提供新思路。     

黄梁木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

为筛选黄梁木(Neolamarckia cadamba)实时定量PCR最佳内参基因, 该研究以黄梁木的根、芽、叶、花、果、皮及形成层为材料, 利用RT-qPCR技术对ACT、CAC、CYP和EF1α等21个管家基因家族43个候选内参基因进行表达量分析, 并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析。geNorm的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(M=0.443), UBQ基因的稳定性最低(M=2.859); NormFinder的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(E=0.223), UBQ基因的稳定性最低(M=4.759); BestKeeper分析显示, UPL基因的标准偏差(SD=0.513)最低。研究结果表明, UPL基因作为内参基因稳定性最高, UBQ基因的稳定性最低。因此可以选择UPL基因作为黄梁木不同组织中RT-qPCR定量分析的内参基因。     

斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。     

皱环球盖菇实时荧光定量PCR内参基因的筛选

本研究以皱环球盖菇Stropharia rugosoannulata不同发育时期(菌丝期、原基期、幼菇期、小菇期、成熟期)、不同组织部位(菌盖、菌柄、菌褶)和不同颜色菌盖(红色、黄色、白色)为试验材料,选择10个内参基因(ACT、GAPDH、TEF、RPL4、PGI、PGM、RPB2、β-TUB、α-TUB、UBQ)并设计跨内含子的引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术进行扩增,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法进行表达稳定性分析以及综合评价算法ReFinder进行加权评比,最终筛选适宜各类样本的内参基因。根据内参基因稳定性的最终排名,最适宜作为不同颜色菌盖内参基因的组合是UBQ和GAPDH,最不适宜的是ACT、PGI和TEF;最适宜作为子实体不同组织部位内参基因的组合是UBQ和RPB2,最不适宜的是ACT、RPL4和TEF;最适宜作为不同发育时期内参基因的组合是ACT和RPB2,最不适宜的是GAPDH、α-TUB和β-TUB。     

miRNA qPCR检测方法研究进展及其应用

miRNA是目前国际研究的热点领域之一,而miRNA表达检测是miRNA研究的基础内容。针对miRNA序列短小的特点,开发出了多种检测方法,其中miRNA qPCR定量检测是应用最广泛的方法。就miRNA抽提,miRNA qPCR定量检测原理及miRNA qPCR定量检测流程包括引物设计、反应体系设置、内参基因筛选等方面进行了深入探讨,并对miRNA定量检测研究方法的发展趋势进行了展望,以期为研究者进行miRNA qPCR定量检测提供参考。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism