重组人可溶性CD14在昆虫细胞表达系统中的表达

BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.     

牛γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有牛γ-干扰素(Bovine interferon-γ,BoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-BoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-BoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达BoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ。采用抗BoIFN-γ单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,表明BoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达。利用VSV*GFP-MDBK细胞系统测定rBoIFN-γ抗病毒活性,重组杆状病毒表达重组BoIFN-γ(rBoIFN-γ)能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上的复制,rBac-BoIFN-γ感染sf9昆虫细胞上清抗病毒活性为2×105IU/mL,而且其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组BoIFN-γ免疫血清阻断。结果表明:rBoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ感染的sf9昆虫细胞中获得良好表达,并具有高效抗病毒活性。     

人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化

旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件。采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gi1α,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1α,测序无误后将融合基因与pFASTBac1重组得重组质粒pFASTBac1-GPR81-Gi1α,而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81- Ci1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件。结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件。该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81- Gi1α融合蛋白的制备。     

16型人乳头瘤病毒衣壳蛋白在真核细胞中的表达

为了构建HPV16型晚期蛋白重组杆状病毒,并使其在昆虫细胞中获得高效表达.首先构建2株重组杆状病毒转移质粒,分别携带人乳头瘤病毒晚期基因L1及L1和L2,再用线性化的杆状病毒DNA与该重组杆状病毒转移质粒共转染sf9昆虫细胞进行同源重组,获得2株重组杆状病毒.经鉴定该重组病毒中有目的基因存在且可表达所编码的L1或L2晚期蛋白.结果表明HPV16型晚期蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础.     

猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫细胞中的表达及其特性

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac^TM1中,获得重组转移载体pFast-OFR2,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体Bac-ORF2,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染sf9细胞,获得重组病毒,命名为Ac-ORF2。间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使Ac-ORF2感染的sf9昆虫细胞呈强的荧光着色; SDS-PAGE与Western-blotting分析可见大小约为28kD的特异性带,表明Ac.ORF2在sf9细胞中成功表达了PCV2-ORF2蛋白。将该表达蛋白纯化并经磷钨酸负染后,通过电镜观察可见形态与PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs),其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳,其直径也为17nm左右。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达

将编码鸡的白细胞介素 1 8(chickeninterleukine 1 8,ChIL 1 8)成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上 ,构建真核转移载体pMelBacBChIL 1 8,经限制性内切酶消化、ChIL 1 8特异引物PCR鉴定和确证性序列测定 ,证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacBChIL 1 8质粒与杆状病毒DNA(Bac N BlueTM DNA)共转染sf9昆虫细胞 ,经四轮蓝斑筛选纯化 ,获得了重组杆状病毒 ,命名为rBaculovirusChIL 1 8。提取病毒染色体DNA ,经ChIL 1 8特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定 ,证明获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞 ,收获接种后不同时间的细胞进行SDS PAGE电泳。结果表明ChIL 1 8基因在昆虫细胞中获得了表达 ,表达的重组蛋白分子量约为 2 3kDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIL 1 8多克隆抗体进行Westernblot分析 ,表明本研究真核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白和前期原核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白均具有生物学活性。     

GII型诺如病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达与定位研究

【目的】利用杆状病毒表达系统表达诺如病毒(GenegroupⅡ)VP2蛋白,分析其亚细胞定位,为深入研究VP2蛋白的功能奠定基础。【方法】设计可扩增完整ORF3基因片段的引物P1和P2,在下游引物中引入6×His标签的编码序列,从质粒pMD-ORF3中克隆了含有6×His编码序列的ORF3基因,与pFastBac1载体连接,构建重组质粒pFB-ORF3,转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒基因组Bac-ORF3,脂质体介导转染sf9昆虫细胞获得表达VP2蛋白的重组杆状病毒Ac-VP2,感染sf9细胞后,收集病变细胞,采用抗6×His标签的单克隆抗体作为一抗进行Western blot与间接免疫荧光实验鉴定。【结果】Western blot实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞在约29 kD处出现特异性条带;间接免疫荧光实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞出现特异性绿色荧光,并且VP2主要定位于sf9的细胞核与细胞膜。【结论】诺如病毒VP2蛋白在Ac-VP2感染的sf9细胞中获得成功表达,并且主要定位于sf9细胞的细胞核与细胞膜。     

重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。     

禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。     

猪肺炎支原体p97 C末端基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

摘要：【目的】构建携猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）黏附因子p97 C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97 C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,该重组穿梭质粒经Pme I线性化后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组获得重组腺病毒DNA,纯化后的重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后转染AD293细胞以获得重组腺病毒。对该重组腺病毒进行RT-PCR、间接     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

HIV-1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体.脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞.结果表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验.     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。     

HIV—1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES－KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV－1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF－1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF－1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV－1感染实验。