八肋游仆虫核糖体蛋白L11的基因克隆与序列分析

以单细胞真核生物八肋游仆虫Euplotes octocarinatus为实验材料,采用PCR、RT-PCR方法克隆了核糖体蛋白L11基因(EoRPL11).将该序列与GenBank中其他物种的RPL11基因序列进行同源性比对,采用DNAStar软件进行聚类分析.结果显示,成功克隆到游仆虫RPL11基因,大核中该基因全长709 bp,开放阅读框(ORF)为531 bp,编码176个氨基酸;cDNA序列与大核中ORF序列一致,表明该基因具有转录活性;所推导的氨基酸序列与嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila的RPL11同源性最高,为66%.     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

油菜profilin基因的克隆和表达分析

profilin是高等植物中的一种与肌动蛋白结合的蛋白,采用RT-PCR技术克隆了油菜（Brassica napus L.cv.canadian tween)花粉中的一个369bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA与已报道的其他植物的profilin基因具有较高核酸序列同源性,与玉米（Zea maysL.)基因同源性为82%,拟南芥（Arabidopsis)基因同源性为85%,水稻（Oryza sativa L.)基因同源性为81%,烟草（Nicotiana tabacum L.)基因同源性为82%,结论5′RACE和3′RACE技术,获得了全长cDNA,其为672bp。该cDNA包含一个开放密码框。5′未翻译区和一个带有Poly(A)的3′区域。Northern杂交结果显示它主要在花粉和花药中表达。     

牡丹CTR1基因家族基因片段及其cDNA 3′-末端的克隆与序列分析

以牡丹品种‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘Luo Yang Hong’)花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的CTR1(Constitutive Triple Response 1)蛋白的保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到3条牡丹CTR1基因同源片段。利用其已知中间序列,通过3′快速扩增cDNA末端技术(3′RACE)及序列拼接,最终得到了这3个基因片段除5′末端外的全部cDNA序列,分别命名为PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3。分析结果表明,由PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3基因翻译的氨基酸片段与拟南芥和番茄的CTR1蛋白氨基酸序列的同源性均较高,分别为88%和85%;61%和61%以及70%和69%。     

石蒜Mg^2＋转运体基因LrMGT的克隆与分析

从石蒜〔Lycoris radiata（L’Hér.）Herb.〕叶片全长cDNA文库中克隆获得Mg^2＋转运体（MGT）基因LrMGT。序列分析结果显示：LrMGT基因的cDNA序列全长1 726 bp,其中开放阅读框（ORF）长度921 bp,编码306个氨基酸。石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列的理论相对分子质量为33 635,理论等电点为pI 5.14,为疏水性膜蛋白,不具有信号肽。序列比对结果表明：石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列与小米〔Setaria italica（Linn.）Beauv.〕、水稻（Oryza sativa Linn.）和拟南芥〔Arabidopsis thaliana（Linn.）Heynh.〕等植物的MGT基因编码的氨基酸序列的相似性较高,相似度达到72%~76%;石蒜LrMGT基因与其他植物MGT基因编码的氨基酸序列的保守区域较大,均具有较高的保守性。在NJ系统树上石蒜LrMGT基因编码的氨基酸序列与禾本科（Gramineae）植物二穗短柄草〔Brachypodium distachyum（Linn.）Beauv.〕、水稻、高粱〔Sorghum bicolor（Linn.）Moench〕和小米MGT基因编码的氨基酸序列聚为同一个分支,表明它们可能具有较近的进化关系。实时荧光定量PCR结果表明：石蒜LrMGT基因在根和鳞茎中的相对表达量较高,在叶片和花中的相对表达量较低,具有明显的组织特异性。     

四翅滨藜Osmotin-like Protein基因的克隆、序列分析及其原核表达北大核心CSCD

在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到四翅滨藜osmotin-like protein的1个cDNA序列,命名为AcOLP。AcOLPcDNA包含一个全长为687 bp完整开放阅读框,编码229个氨基酸,属于GH64-TLP-SF超家族,是一种病程相关5(PR-5)蛋白,其核酸序列与大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)的osmotin-likeprotein基因的同源性为94%,对应编码氨基酸序列同源性为87%。将得到的序列提交GenBank,序列号为JN632587.1。与其他植物PR-5蛋白的氨基酸序列比对,AcOLP具有保守的半胱氨酸残基,与二硫键的形成有关。对AcOLP与其他植物的氨基酸序列的进化分析表明,其与大洋洲滨藜的亲缘关系较近。将AcOLP基因与原核表达载体pET-28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约29 kD的蛋白。     

石蒜儿茶酚氧位甲基转移酶基因克隆与原核表达

采用同源克隆与RACE相结合的方法,首次从石蒜叶片中克隆到可能与加兰他敏生物合成相关的儿茶酚氧位甲基转移酶基因,命名为LrCOMT。核酸序列分析显示,该cDNA全长1 246bp,开放阅读框1 101bp,编码366氨基酸。氨基酸序列分析与比对发现,LrCOMT编码的氨基酸序列具有COMT蛋白的特征区域,且与鸢尾、玉米、烟草等植物COMT的同源性大于60%。将LrCOMT基因连接到原核表达载体pET-29a上,转化大肠杆菌BL21(DE3)的原核表达结果显示,重组蛋白受IPTG诱导表达,分子量大小约为40kD,与已报道的其他植物COMT大小基本一致。     

二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.     

西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3% NaHCO₃溶液胁迫处理48 h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1 302 bp,5′非翻译区为59 bp,3′非翻译区为25 bp,开放读码框为1 218 bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。