人工合成多样性突变文库研究进展*

突变文库的构建是定向进化研究过程中一个关键步骤,主要利用天然存在的系统或者人工合成的分子技术来产生多样性核酸分子文库,为制备和筛选具有一定特性的蛋白酶、多肽、人工抗体等提供庞大的遗传基因库,也可用于合成生物学中相关基因元件的研究与筛选,为目标生物制品的高效工业化生产提供动力。随着对突变文库构建技术研究的日益深入,各种文库构建策略相继被开发出来,并在生物能源、生物化工、生物医药、生物试剂和食品工业等方面得到了广泛的应用。然而,定向进化中的文库构建策略多有不同,各种突变文库构建技术的核心方法也在不断创新。主要介绍近年来实验室中人工合成多样性文库的前沿技术,并对文库构建技术在自动化和智能化方向的发展进行了展望。     

基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、高效、准确地实现基因组编辑,因而在功能基因研究中得到更广泛应用。而基于CRISPR/Cas9系统的宿主全基因组sgRNA文库高通量筛选技术平台,可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子,通过明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期,为分子病毒学和免疫学提供了强大的研究工具。本文主要总结了基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台的具体筛选流程,归纳和讨论了该平台在筛选调控病毒复制相关宿主因子中的应用现状和发展前景。     

基因人工进化的分子育种技术

分子育种技术(molecular breeding technology)利用人工手段模拟生物杂交优势的分子进化模式,在体外构建含有感兴趣基因的大量突变文库,并根据基因表达产物的特性,以合适的筛选方法选择具有最佳功能的改良基因。经过近几年的快速发展,分子育种技术在创造高效随机基因突变库的方法上日臻完善,已在医学、工业和环境保护酶类研究等方面收到了很好的成效。预计未来该技术将广泛地应用于重要传染性疾病(如疟疾、艾滋病病毒等)的预防和治疗,尤其可通过DNA疫苗手段的应用而获得强大的生命力。作者全面地综述了分子育种技术的产生、发展和应用现状。     

以噬菌体作为配基的一种新型亲和材料的制备方法研究

目的:针对亲和层析材料制备困难的问题,本文拟研究以聚丙烯酰胺冷凝胶为基质,以噬菌体展示多肽为配基制备亲和材料方法的可行性.方法:以低温聚合制备的聚丙烯酰胺冷凝胶作为基质,将筛选噬菌体展示人肝脏cDNA文库获得的噬菌体作为配基,通过两种不同的化学键合方法键合于凝胶表面,制备亲和材料.通过高效液相色谱法(HPLC)分析此亲和材料对药物分子是否具有亲和能力.结果:聚丙烯酰胺冷凝胶具有较大的孔径及良好的亲水性,适用于生物大分子如噬菌体的键合,键合特异噬菌体展示多肽的凝胶材料与键合未筛选噬菌体文库的亲和材料比较,对药物分子具有明显的高亲和力.结论:以展示特异多肽的噬菌体为亲和配基,以聚丙烯酰胺冷凝胶为基质,通过化学键和方法制备亲和材料是具有可行性的,此种亲和材料在生物分子纯化特别是药物分析纯化、蛋白质分离纯化以及细胞分离分析等方面将具有一定的应用前景.     

微卫星标记在分子生态学中的应用及其位点的分离策略

微卫星DNA作为一种优良的遗传标记在分子生态学领域得到了广泛应用,本文综述了其在分子种群生物学、分子环境遗传学、分子适应等研究领域中的应用情况.微卫星位点的获得是开展各项研究的前提,传统的构建微卫星文库再杂交筛选的方法工作量大、效率低,因而在实践过程中又产生了富集文库法、PIMA法、FIASCO法等新的分离策略.本文对几种微卫星位点分离技术进行介绍并对其进行分析比较,为分子生态学研究过程中微卫星位点筛选方法的选择提供参考.     

宏基因组学挖掘新型生物催化剂的研究进展

微生物蕴藏着大量具有工业应用潜力的生物催化剂。然而,传统培养方法只能从环境中获得不到1%的微生物。宏基因组学是通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库并对文库进行筛选,寻找和发现新的功能基因的一种方法。它绕过了微生物分离培养过程,成为研究环境样品中不可培养微生物的有力手段。因此,从宏基因组中挖掘新型生物催化剂一直倍受生物学家的关注。以下主要对宏基因组文库的样品来源、DNA提取方法、文库的构建和筛选策略的选择这4个方面的研究状况进行了综述,列举了近年来利用宏基因组技术所获得的新型生物催化剂,并对其今后的研究方向提出了展望。     

宏基因组学结合合成生物学法挖掘新型生物催化剂的研究进展

生物催化剂是具有催化活性的细胞和酶的统称,因其高效和环境友好的特性被广泛应用于工业、农业、医药和能源等领域。传统的生物催化剂挖掘技术依赖于生物分离及体外培养,在一定程度上阻碍了生物催化剂的发展。宏基因组学挖掘新型生物催化剂通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,再基于功能活性和序列分析筛选新型生物催化剂,避免了微生物的分离培养。合成生物学是利用工程学原理,通过元件的设计,组合和系统的构建对生物途径、有机体或生物系统进行重新设计。综述了宏基因组学方法挖掘新型生物催化剂的最新研究进展,并对利用合成生物学方法改进宏基因组筛选新型生物催化剂的效率进行了讨论。     

化学修饰寡核苷酸在核酸配基扩增技术中的应用

核酸酸基扩增技术（SELEX)可从极大容量的随机寡核苷酸文库中筛选得到与靶分子高特异性和高亲和力结合的核酸配基。对寡核苷酸进行化学修饰,可以提高核酸配基的稳定性,增加其功能多样性及生物利用度。SELEX在基础研究、诊断和治疗试剂的研制及药物筛选等领域有广泛用途。     

核糖体展示技术

组合化学在分子生物学中的应用,大大提高了所构建分子文库的容量,而高通量筛选技术对于大容量文库的筛选是至关重要的。核糖体展示技术克服了传统筛选技术库容量小和筛选效率低等缺陷。该技术完全在体外进行,其文库容量不受细胞转染效率的影响,库容量和筛选效率得到很大提高,可与其他技术相组合,在体外分子高效表达和定向进化方面具有广泛的应用前景。该文介绍核糖体展示技术的基本原理、技术特点以及最新研究进展。     

元基因组文库分析技术研究进展

随着新的分析技术的不断出现和成熟,促进了微生物分子生态学及相关学科的诞生和迅速发展。其中,元基因组文库分析技术即是近年来微生物分子生态学研究领域兴起的一种新的分析技术。就元基因组分析技术诞生的背景及该技术的原理进行了讨论,着重阐述了元基因组文库分析技术在寻找新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性、人类元基因组测序等方面的应用。另外,归纳总结了目前国际上常用的诸如PCR为基础的筛选、荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization,FISH）、底物诱导的基因表达筛选（substrate induced gene expression screening,SIGEX）、基因芯片等元基因组文库筛选方法,并就不同方法的优缺点进行了分析和讨论,指出了目前元基因组文库分析技术存在的主要问题并对今后该技术的发展进行了展望。     

宏基因组学结合合成生物学法挖掘新型生物催化剂的研究进展

生物催化剂是具有催化活性的细胞和酶的统称,因其高效和环境友好的特性被广泛应用于工业、农业、医药和能源等领域。传统的生物催化剂挖掘技术依赖于生物分离及体外培养,在一定程度上阻碍了生物催化剂的发展。宏基因组学挖掘新型生物催化剂通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,再基于功能活性和序列分析筛选新型生物催化剂,避免了微生物的分离培养。合成生物学是利用工程学原理,通过元件的设计,组合和系统的构建对生物途径、有机体或生物系统进行重新设计。综述了宏基因组学方法挖掘新型生物催化剂的最新研究进展,并对利用合成生物学方法改进宏基因组筛选新型生物催化剂的效率进行了讨论,以期提高挖掘新型生物催化剂的效率。     

基因组文库构建及其在保护遗传学中的应用前景

基因组文库是进行分子克隆和基因组结构与功能研究的基础。完整的基因组文库的构建, 使任何DNA 片段的筛选和获得成为可能。随着不同克隆载体的相继出现, 基因组文库也经历了一系列的发展过程。其中, BAC文库因其转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收, 以及容载量较大等优点而被广泛应用。近几十年来, 随着环境的日益恶化、分子遗传学技术的迅速发展, 以及保护生物学和分子遗传学的不断相互渗透, 孕育产生了保护遗传学这一分支学科。作为保护遗传学中物种保护策略的重要部分, 建立濒危野生动植物的基因组文库, 是保存其种质资源的最为有效的实际手段和方法, 并能为进一步开展与生殖、疾病和重要经济性状等方面有关的功能基因的研究, 提供可靠的材料保证。     

蛋白质定向进化的研究进展

在工业生物催化过程和生物细胞工厂构建方面,蛋白质定向进化被广泛地应用于酶的分子改造.蛋白质定向进化不仅可以针对某一目的蛋白进行改造,还可以改善代谢途径、优化代谢网络、获得期望表型细胞.为了获得更高效的突变效率,快捷、高通量的筛选方法,提高蛋白质定向进化的效果,研究者不断开发蛋白质体内、体外进化方法,取得了新的进展和应用.本文介绍了最近发展的蛋白质定向进化技术的原理、方法及特点,总结了突变文库的筛选方法和蛋白质定向进化的最新应用,最后讨论了蛋白质定向进化存在的挑战和未来发展方向.     

SELEX技术及近年研究进展

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术。该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适配子与抗体类似,可以与相应靶物质特异性结合。SELEX技术筛选适配子的技术有快速的进步,而适配子也被应用到医学生物学等各个方面。在HIV等病毒学研究与治疗方面,SELEX的应用也有了可观的进展,多种病毒的相关适配子被筛选出来,为病毒相关疾病的防治提供了新的方向。本文主要就近三年来的SELEX技术发展状况及在应用上的发展进行简要综述。     

文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法

利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv单链抗体方面的应用,包括ScFv单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势.     

RNA干扰文库及其在功能基因组学研究中的应用

随着人类基因组大规模测序的完成,下一步的挑战是了解每一个基因的功能 . RNA 干扰文库为大规模基因功能筛选提供了可能 . 虽然用于线虫等模式生物的 RNAi 文库,已经证明是大规模基因功能筛选的有效方法,但这些文库不能用于高等动物的细胞 . 自 2003 年以来,用于人的细胞和哺乳动物细胞的 RNAi 文库取得了突破,相继出现构建已知基因 RNAi 文库和构建随机 RNAi 文库的报道,并成功地应用于大规模基因功能的筛选 . RNAi 文库作为一种简单、高效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具,将在基因功能研究、发现新的药物靶基因、发现疾病相关基因等方面有广阔的应用前景 .     

SELEX技术及Aptamer研究的新进展

综述了近几年指数富集的配体系统进化(SELEX)技术的改良与寡核苷酸配基(aptamer)研究应用方面的新进展.Aptamer是指利用SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术,从随机寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的短单链寡核苷酸配基,通常具有纳摩尔到皮摩尔的亲和力.高通量筛选的技术特点与aptamer精确识别、易体外合成与修饰等特性,使得aptamer在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景.     

体外突变新技术：DNAShuffling技术

体外DNAshuffling技术是一种快速、高效并且衫的分子定向进化技术,和以往的基因突变技术不同,它是一种高通量的突变筛选技术,可以对靶序列进行多次重组和选择,利用该技术建立的突变文库（嵌合文库）具有容量大、多样性好等优点,且更易于实现有益突变的积累。DNAshuffling技术已广泛应用于酶、药物蛋白及其它功能蛋白的改造,并取得了相当大的成功,显示了该技术在蛋白质改造和分子育种方面的潜在应用价值。     

古DNA单链测序文库的建立与检测北大核心CSCD

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

古DNA单链测序文库的建立与检测

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。