草鱼早期胚胎胚盘细胞表面微区元素的研究

本文应用扫描电镜Ｘ射线能量色散分析技术,对草鱼早期胚胎胚盘区细胞的表面元素进行了分析,结果表明：（１）草鱼胚胎细胞表面含有Ｎａ,Ｍｇ,Ａｌ,Ｓ,Ｃｌ,Ｋ和Ｃａ（２）七种元素在胚胎各期的相对含量是不同的,并且各种元素在胚胎发育中的变化曲线也是不同的。     

胚胎干细胞向造血系统的分化

胚胎干细胞是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞,可分化形成各种组织类型。在合适的条件下,胚胎干细胞可发育成造血干细胞及各类成熟血细胞,为造血干细胞移植及血细胞输注开辟了新的来源,同时也为造血发生及造血调控研究提供了有效可靠的模型。本文将综述ES细胞向造血系统分化的诱导条件、调控机制及应用前景。     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的基因芯片分析

弄清胚胎肝脏发育的分化调节机制,对指导干细胞在肝再生中的应用以及研究肝分化相关疾病分子机制具有重要意义．胚胎干细胞的全能性使得体外建立肝向分化模型成为可能,采用单层贴壁培养方式,分阶段加入成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素(OSM)等因子,诱导小鼠胚胎干细胞D3(mESC-D3)的肝向分化．分化细胞在光镜和电镜下呈现肝样细胞形态,RT-PCR、细胞免疫荧光检测以及PAS染色分析表明,这些细胞具有肝细胞特征性的基因表达和生化功能．采用干细胞分化相关基因芯片比较早期肝定向分化前后的基因表达差异,结果显示,48个差异表达基因中(大于2倍),20个上调、28个下调．进一步的生物信息学分析发现,它们集中体现在细胞外基质、细胞连接、FGF、BMP分子及Notch、Wnt信号通路上,提示这些改变可能与胚胎早期的肝向分化密切相关．     

LAS和DEHP对草鱼胚胎和鱼苗的毒性效应

LAS对草鱼胚胎及鱼苗96h LC50值分别为4．2mg/L及5．6mg/L。胚胎发育在高于5．6mg/L时出现发育畸形。DEHP在乳化后浓度高达1000mg/L对虹将幼鱼未见急性毒性,在饱和的DEHP溶液中暴露30d的胚－鱼苗阶段试验也未见明显的毒性效应。     

哺乳动物早期胚胎细胞的极性与分化

哺乳动物早期胚胎细胞具有极性,在桑椹胚以前细胞极性由不稳定变为稳定。细胞极性包括表面极性和细胞质极性。细胞极性与滋养层和内细胞团两种细胞系的建立密切相关。细胞的极化使细胞形成顶-基轴,细胞分裂后,顶半球产生的极性子细胞分化为滋养层,基半球产生的非极性子细胞建立了内细胞团。内细胞团偏向胚泡一侧,使胚胎形成了胚-对胚轴(EA轴)。细胞分化是许多因素的综合效应,不能简单地归结为决定子的单独作用。     

利用胚胎干细胞分化的拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有分化的全能性已经得到广泛共识。ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层、柱状上皮细胞的分化,以及中央空腔的形成。本文介绍利用拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程中各个胚胎阶段的发育、细胞程序性死亡的发生及TGF-β信号在胚胎发育过程中的作用。     

维甲酸和EGF对大鼠脑胚胎神经干细胞增殖和分化的影响

目的 观察全反式维甲酸(RA)和表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响。方法 从大鼠胚胎脑中分离神经干细胞,经RA和EGF处理后,用台盼蓝确定细胞数量,BrdU标记分析细胞生长能力,采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果 20ng／ml EGF和1μmol／LRA处理的培养细胞均显示增殖效应,但EGF处理组增殖速度明显高于RA组,悬浮细胞中有大量nestin和BrdU阳性细胞。用EGF和EGE／RA诱导的神经元分化率分别为17％和31％,而RA处理的神经元分化率显升高至89％。由EGF、EGF／RA和RA诱导的星形胶质细胞分化率分别为83％、69％和11％。结论 EGF主要促进神经干细胞增殖并主要诱导星形胶质细胞的生成,RA主要诱导神经干细胞向神经元分化,二无明显协同效应。     

破解胚胎干细胞分化的谜团

最近的两项新研究表明胚胎干细胞除了医用价值之外，还使破解人类生物学的基本秘密获得了重要进展。Whitehead研究所的Richard Young和Rudolf Jaenisch实验室与哈佛的Douglas Melton以及麻省理工的David Gifford合作确定出了控制胚胎干细胞基因组的一个关键发育成分。这项研究计划获得的小鼠研究结果公布在Nature杂志上，而人类研究结果则公布在Cell杂志上。     

胚胎干细胞的诱导分化研究

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞, 具有发育上的全能性. 近两年在ES细胞诱导分化方面的研究取得了一些突破性的进展, 其中, ES细胞向生殖细胞分化(2003年)以及首次克隆成功人ES细胞(2004年)先后被评为《科学》杂志当年度十大科学进展之一; 另外, 维持ES细胞不分化状态的关键基因(Nanog)及相关化合物(BIO)的发现, 其自身分化状态调控机理的深入研究, 以及向不同方向诱导分化和应用等的研究成果, 同样受人关注.     

三株草鱼出血病病毒免疫原性的比较

从湖南邵阳、湖北仙桃、武汉南湖地区分离到的三株草鱼出血病病毒(GCHV873、GCHV875、GCHV876),分别对家兔进行免疫,并测定了它们在家兔体内形成抗体的水平以及这些抗体对相应抗原的中和能力。实验结果显示:GCHV873产生抗体滴度比GCHV875高一倍,较GCHV876高8倍;其抗体的中和效价分别是1:1778(10~(-3.25))、1:386(10~-(2.59))和1:181(10~-(2.25))。上述结果表明:GCHV873的免疫原性是三个分离株中最强的一个毒株。     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873 、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究。结果表明 ,GCRV873 、GCRV875、GCRV876在 - 30℃保存 10年后仍然具有一定的感染性 ,其滴度均在 10 2 TCID50 /mL以上 ,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价。经传代培养后 ,四株GCRV的毒力逐渐升高 ,并趋于稳定 ;当感染复数 (MOI)为 0 .0 5PFU/cell时 ,测定四株GCRV的滴度均高于 10 8TCID50 /mL ,但略有差异。GCRV873 的滴度最高 ,可达到 6 .4× 10 11TCID50 /mL。连续传代的GCRV毒株在不同温度 (2 8℃、31℃、34℃、37℃、41℃ )条件下 ,均可感染CIK细胞 ;在 2 8℃时 ,感染效价最高 ,随着温度的升高 ,其感染效价逐渐降低     

青草鲢鳙四种鱼同工酶的比较研究

采用聚丙烯酰氨垂直板状连续电泳方法,对青草鲢鳙６种组织、１０种同工酶和蛋白质进行了电泳研究,并结合作者以前做的工作,对所研究的共２１种同工酶和蛋白质在４种鱼中的组织分布,位点表达及活性作了分析和总结。结果表明：４种鱼同工酶的种内组织分布差异大于种间差异;ＡＤＨ、ＡＭＹ、ＣＡＴ、ＥＳＴ、ＭＥ、ＰＯＸ、ＳＤＨ存在不同程度的种间差异,可作为种类的遗传标记;４种鱼ＭＤＨ、ＧＯＴ、ＡＬＰ、ＡＯ、ＳＯＤ同工酶谱非常相似,只在活性上略有差异;ＬＤＨ、Ｇ６ＰＤＨ和ＣＯＸ的酶谱特征可作为青草和鲢鳙两个亚科的鉴别标记。     

草鱼出血病病毒基因组的cDNA合成、克隆及部分序列分析

采用差速离心的方法纯化感染草鱼出血病病毒的细胞悬液。提纯的病毒粒子经蛋白酶Ｋ处理和酚氯仿抽提,在１％琼脂糖凝胶电泳条件下分离得到１１条ｄｓＲＮＡ,利用柱离心式胶回收试剂盒纯化各基因片段。纯化的ｄｓＲＮＡ溶于９０％的ＤＭＳＯ中,７０℃变性１５ｍｉｎ,然后采用随机引物法反转录合成各基因片段的ｃＤＮＡ,并平头连接于ｐＺＥｒＯ２．０载体的ＥｃｏＲＶ位点,电转化ＴＯＰ１０感受态细胞。重组质粒经酶切、ＰＣＲ扩增得到大小不等的插入片段,ｃＤＮＡＲＮＡ斑点杂交的结果进一步证实其插入为目的基因片段。采用循环ＰＣＲ测序的方法,对其插入片段进行了序列测定,对其中第１１片段的部分序列作了报道。     

草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究

本文采用α-[~(32)p]ATP标记物在鱼肾细胞系(CIK)系统中,对草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)基因组进行了体内转录的研究。通过放线菌素D抑制宿主细胞基因组的转录活动,从感染病毒细胞中分离出病毒的mRNA,分别采用液相杂交和Nortbern blot方法检查病毒mRNA的转录情况。试验结果表明,GCHV含有内源性转录酶,其基因组的转录活动是在病毒感染细胞后4小时开始,由早期基因所转录,8—10小时获得晚期基因的转录产物。这些mRNA的大小、数目大体上与病毒基因组一致。     

草鱼出血病病毒的生长特性及高滴价培养

草鱼出血病病毒感染鱼肾(Clk)单层细胞后,产生明显的细胞病变,其繁殖周期为2—3天。病毒增殖的上升期在感染后的12—48小时。28℃下,当感染复数(Multiplicityof Infection简称MOI)为0.05PFU/cell时,病毒滴价可达1.78×10~(11)PFU/ml,不同温度(25℃、28℃、30℃)下通气培养,测定病毒滴价略有差异。感染病毒的细胞培养液经ELISA检测和电子显微镜观察均为阳性结果,并且能感染健康草鱼。     

从随机噬菌体肽库中筛选抗草鱼出血病病毒多肽的研究

从随机噬菌体九肽表位库中筛选出抑制草鱼出血病病毒（ＧｒａｓＣａｒｐＨｅｍｏｒｈａｇｅＶｉｒｕｓ,ＧＣＨＶ８７３）感染的多肽分子。采用完整、生物素化的草鱼出血病病毒颗粒作为受体,与以融合蛋白形式在丝状噬菌体ｆＵＳＥ５的外壳蛋白Ⅲ的Ｎ端表达的随机九肽库作用。经三轮体外亲和筛选（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）及ＥＬＩＳＡ法检测后,从肽库中筛选出１６个与病毒高亲和力结合的噬菌体克隆,其中六个阳性克隆能有效地抑制病毒在ＣＩＫ细胞中的复制,并使病毒的半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤ５０）下降五个数量级。表明噬菌体肽库技术完全能够应用于抗病毒研究,为研制抗病毒短肽制剂打基础。     

饥饿对草鱼非特异免疫水平的影响

研究了长期饥饿对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)非特异性免疫水平的影响。实验选取平均体质量(31.86±1.47)g的草鱼,随机分为2个实验组(对照组和饥饿组),每组3个平行,饥饿处理15、30、45和60 d,测定饥饿对草鱼头肾和脾中自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性、血清和肝胰脏中溶菌酶活性、血清中碱性磷酸酶活性的影响。结果表明:受饥饿胁迫的影响,草鱼自然杀伤性细胞在脾和头肾中的杀伤活性显著低于对照组(P0.05)且不随着饥饿时间的延长发生显著性变化;随着饥饿时间的延长,血清和肝胰脏中溶菌酶呈现先升高后降低的趋势,血清碱性磷酸酶在饥饿15、45、60 d时显著低于对照组;饥饿组的碱性磷酸酶活性在饥饿30 d以后,维持恒定。由此可见,长时间的饥饿胁迫降低了草鱼的免疫水平。相比较而言,自然杀伤细胞的杀伤活性在反映鱼类免疫状况时比溶菌酶和碱性磷酸酶可能更为灵敏。     

草鱼出血病病毒对其它鱼的感染性研究

用草鱼出血病病鱼分离出的草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)感染其它常见鱼并用ELISA方法检查感染鱼组织提取液,结果表明:青鱼、鲢鱼、布氏鳌条对GCHV抗体呈阳性反应;鲤鱼、鳙鱼、鲫鱼、团头鲂、泥鳅则呈阴性反应。综合感染鱼发病症状及死亡特征,初步认为:青鱼对GCHV是易感的,GCHV能在鲢鱼、布氏蟹条体内增值,但毒力较低,鳙鱼、鲫鱼、团头鲂、鲤鱼、泥鳅能抗GCHV感染。