大鼠肝癌细胞中失活的肿瘤相关基因的克隆和筛选Ⅱ.肿瘤细胞恶…

构建表达性载体和大鼠正常肝表达性ｃＤＮＡ文库,利用该库转染经致癌剂诱发的大鼠肝癌细胞ＣＢＲＨ－７９１９,得到和分离出一系列表型性状逆转的克隆。生长曲线、软琼脂测试和裸鼠实验表明这些整合了外源ｃＤＮＡ的克隆原有生长表型的恶性程度均有显著的降低。     

癌细胞逆转过程中N-cadherin与间隙连接蛋白Cx43功能表达的关系

钙粘合蛋白 (N cadherin ,N cad)在人肺癌细胞的表达明显低于正常人肺细胞 .肺癌细胞的间隙连接通讯功能缺陷 ,连接蛋白Cx43表达抑制 .Cx43cDNA转染肺癌细胞的 4个阳性克隆其Cx43蛋白表达升高水平相近 ,但通讯功能有差别 ,与各克隆N cad的表达水平有正相关性 .N cad表达高的克隆Cx43在膜间隙连接的分布和通讯功能最明显 ,细胞分化改善 ,在裸鼠体内生长抑制 (抑制率 75 % )有显著性 .反之N cad表达低的克隆Cx43在膜间隙连接不明显 ,细胞通讯功能弱 ,恶性表型无逆转 .提示N cad与Cx43转录后表达过程的调节密切相关 ,两者介导的粘合和通讯功能有协同促进肺癌细胞逆转的作用 .     

新型人肝再生增强因子的分子克隆及其性能研究

肝再生增强因子(ALR)是新近发现,存在于新生大鼠肝组织中的一种新的肝增殖刺激因子,其人源性对应序列未见报道.研究在克隆大鼠ALRcDNA的基础上,首次报道了依据cDNA序列推导的人ALR的氨基酸序列;将人ALR编码区cD-NA亚克隆于真核表达质粒pcDNAⅠ,转染cos-7细胞后,发现其表达产物具有促进HTC肝癌细胞增殖的作用;Northern杂交提示人 ALR mRNA比大鼠ALR mRNA大,约l.4kb,表明人ALR cDNA具有更长的非翻译区序列;除肝脏外,ALR mRNA在胸腺及肾等人胚胎组织中也有较高丰度表达;正常大鼠肝组织仅低丰度表达ALRmRNA,但 2/3肝部分切除后12h肝组织ALR mRNA表达明显增高,提示 ALR可能是一种重要的肝再生刺激因子.     

抑瘤素McDNA的克隆及表达研究

抑瘤素M（onecostatinM,OSM）是一种多功能的细胞生长调节因子．从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑癌素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化DH5a进行模拟表达,SDS-PAGE分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白5％,经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长．     

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因的克隆和表达

同型半胱氨酸血症是心血管病和出生性缺陷的一个危险因素 .5- 1 0- 亚甲基四氢叶酸还原酶活力的降低是引起高同型半胱氨酸血症的一个重要原因 .克隆了人和大鼠的 5- 1 0 -亚甲基四氢叶酸还原酶的cDNA ,构建了人MTHFR的原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达出MTHFR的蛋白质 .并且初步发现 ,IL- 1和同型半胱氨酸均可以促进大鼠MTHFR基因的表达     

血管生成抑制因子K4K5 Cdna基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用PCR方法,扩增人纤溶酶原cDNA基因中K4K5 cDNA片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,获得表达质凿p9kkk-18。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418－YPD筛选高拷贝表型,PCR筛选K4K5 cDNA与酵母染色体整全形成的阳性克隆,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达产物r-K4K5分子量约21.5kD,占分泌总蛋白80％以上,产物浓度为150－250mg/L。初步纯化产物抑制牛毛细血管内皮（BCE）细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成。     

抑瘤素M cDNA的克隆及表达

抑瘤素M(Oncostatin M,OSM)是一种多功能的细胞生长调节因子。从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中,筛选3个阳性克隆进行序列分析,与国外报道序列完全一致;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化大肠杆菌DH5α进行模拟表达,SDS-PAGB分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白的5％;经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长。     

大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备

为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体.采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体.用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价.序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的.本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上.制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000.获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础.     

成年核移植山羊生长相关基因的表达分析

体细胞核移植过程有可能影响克隆动物生长相关基因尤其是印迹基因的表达水平。本研究运用同源引物 PCR 扩增、RACE 技术并结合同源克隆策略, 克隆了 7 个山羊生长相关基因包括 3 个印迹基因(H19、IGF2 和 IGF2R)和 4 个非印迹基因(IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR)的完全 CDS 或者部分 cDNA 序列, 经生物信息学技术确认后, 用荧光实时定量 PCR 对 8只成年克隆山羊中这些基因的表达水平进行分析, 结果表明 3 个印迹基因中 IGF2R 基因表达水平极显著高于对照组的自然繁殖山羊(P<0.01), 而 H19 和 IGF2 的表达则没有很大区别; 4 个非印迹基因中只有 IGF1R 的表达水平极显著高于对照组(P<0.01), IGF1、GHR 和 GHSR 的表达与对照组相似。表明即使在表型正常的成年克隆动物也存在一定的表观遗传异常。通过对获得完全 CDS 和 3′UTR 的 IGF2 基因经过生物信息学分析表明, 山羊 IGF2 基因包含一个 540 bp 的开放阅读框 (ORF)编码 179 个氨基酸。IGF2 基因 cDNA 序列和氨基酸序列以及其它基因部分序列比较分析表明, 山羊所有这些基因与绵羊的同源性要高于同牛的同源性。     

重组人胶质细胞源性神经营养因子的生物学活性研究

从人星形胶质细胞瘤BT-325细胞中克隆胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) cDNA序列.以大肠杆菌作为表达系统,GDNF蛋白在大肠杆菌JM103中获得了高效表达;表达产物经纯化、复性后,以8日龄鸡胚背根节（DRG）、14日龄胎鼠脊髓前角运动神经元以及新生大鼠大脑皮层胶质细胞作为实验材料,研究了GDNF的生物学活性,结果表明： rhGDNF可有效地促进DRG突起的生长,rhGDNF对体外培养的运动神经元表现出明显的促突起生长作用,并可显著提高体外培养运动神经元的存活率,rhGDNF 对体外培养的胶质细胞具有促增殖作用.     

大鼠正加速度高耐力相关基因的分离

 为从基因水平上揭示正加速度 (+Gz)高耐力产生机理及寻找 +Gz高耐力相关功能性蛋白 ,利用抑制消减杂交技术分离 +Gz高耐力相关基因 .雄性SD大鼠在离心机上处理后 ,选取耐受终点在高、低两个极端的动物 ,立即取全脑 ,分离mRNA .以高耐力者为Tester ,低耐力者为Driver,利用抑制消减杂交技术进行 +Gz耐力处于高、低两个极端动物脑组织间基因表达差异显示 ,获得 +Gz高耐力大鼠脑组织相关cDNA .以高、低耐力大鼠脑组织mRNA来源的cDNA为探针 ,对获得的cDNA克隆进行斑点杂交 .分别以杂交筛选出的阳性克隆为探针 ,对高、低耐力大鼠脑组织总RNA进行Northern杂交分析 .两次杂交结果均选择高耐力组杂交信号是低耐力组 3倍以上的cDNA克隆 .经过斑点杂交筛选 ,从大鼠脑组织中获得了 6 7个在 +Gz高耐力大鼠脑组织中上调表达的cDNA克隆 .Northern杂交分析发现 ,钙离子 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ亚基 (Camk2b)和一未知基因在 +Gz高耐力大鼠脑组织中的表达量增加 .结果提示 ,+Gz耐力处于高、低两个极端的大鼠脑组织基因表达有明显差异 ,这些差异表达的基因很可能与 +Gz高耐力的产生有关 ,且钙离子 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ亚基和一未知基因是初步获得的与 +Gz高耐力的产生特异相关的基因     

Wistar大鼠CD9的cDNA克隆、原核表达及生殖腺中的检测

为了用Wistar大鼠研究CD9对精卵融合的影响和与其它精卵融合相关蛋白的作用,克隆了Wistar大鼠的CD9cDNA.测序结果显示,Wistar大鼠的CD9 cDNA编码区与GenBank中发布的SD( Sprague-Dawley)大鼠相同,但在3′非翻译区多一个T.用Western blotting方法检测Wistar大鼠睾丸和卵巢总蛋白发现睾丸和卵巢里均表达内源性CD9蛋白,分子量相同.此外,在大肠杆菌中表达了GST-CD9融合蛋白,并用GST标签纯化CD9蛋白,为体外研究CD9与其它精卵融合相关蛋白的作用提供参考.     

人巨细胞病毒IE基因调节子特异DNA结合蛋白cDNA的克隆和鉴定

本文利用人巨细胞病毒(HCMV)IE基因调节子中特异DNA片段作为探针,自人Hela细胞cDNA表达库中筛选并分离出两个编码能与该探针结合的DNA结合蛋白cDNA克隆(DJ-1和EH-2)。其中EH-2编码的蛋白具有明显的DNA结合序列特异性。比较DJ-1和EH-2克隆在HCMV戚染不容性和可容性畸胎瘤细胞中mRNA表达水平,未见明显差异。DJ-1和EH-2克隆可能涉及IE基因表达调控过程。     

pIRES2-EGFP-IL-1ra-Fcε真核表达载体的构建及鉴定

采用RT-PCR方法从哮喘大鼠脾细胞中克隆IgE恒定区cDNA,同时从载体pBV220-IL-1ra中克隆IL-1ra基因.利用重叠延伸PCR技术构建IL-1ra-Fcε融合基因.将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,以脂质体法转染293T细胞,同时采用气管滴注方式滴注大鼠肺部.经Westernblot、RT-PCR及荧光显微镜观察此融合基因在293T细胞及大鼠肺组织中实现了表达,为过敏性哮喘基因治疗奠定了基础.     

大鼠肝脏脂酶基因的PCR扩增、序列分析和克隆

报导了应用聚合酶链式反应（PCR）技术,扩增大鼠肝脏脂酶基因及其克隆和序列分析的结果．经31个循环的扩增,得到大鼠肝脏脂酶及其N端结构域的cDNA,前者为1508bp的片段,后者为1076bp的片段．克隆后,对此二片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了DNA序列,并已将它们克隆到表达载体pGT－d中．     

HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的：克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法：从感染HSV-1 F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果：成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论：成功克隆出UL30cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。     

大鼠电子传递黄素蛋白-泛醌氧化还原酶cDNA的克隆、功能表达和细胞定位

从大鼠肝线粒体纯化得到一个内膜结合蛋白, 经蛋白酶水解发现丰度最高的两个肽段含有相同的一个14肽序列. BLAST同源搜索找到了与这个14肽对应的大鼠基因组DNA. 利用RACE的方法得到一个完整开放阅读框的cDNA, 编码含616个氨基酸残基的蛋白质序列. 克隆得到的大鼠cDNA与人的ETF-QO具有很高的同源性. 通过序列比较发现克隆得到的cDNA对应大鼠ETF-QO的蛋白前体ETF-QOp, 而从大鼠肝线粒体纯化得到的内膜结合蛋白则是ETF-QO. 构建的pYES/ETF-QO在酵母中的表达产物富集于线粒体组分, 并具有ETF-QO的氧化-还原活性, 因此获得了ETF-QO在酵母中的功能表达, 表明ETF-QOp N端32肽是线粒体的引导肽, 且FAD及[4Fe-4S]被正确地组装. ETF-QO在大鼠的心、肝、肾表达较高, 而在脾与肺却很低. 在动物细胞中表达了ETF-QOp的GFP融合蛋白, 它在细胞内与线粒体的特异染料呈共定位.     

大鼠肝癌演进中凝血因子V的可变剪接

为得到未知差异表达基因EST-5全长及探讨其在SD大鼠肝癌演进中的作用,采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),扩增5'端和3'端序列,PCR产物TA克隆后测序,BLAST检索分析所得序列.结果显示,该序列与挪威大鼠coagulation factor...     

BRD7基因调控区的克隆与功能研究

BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆得到的一个新的Bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因能部分逆转鼻咽癌细胞的恶性表型.为了揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,利用生物信息学技术已预测出其启动子区.荧光素酶活性检测结果表明该区域具有强启动子活性;转录因子Sp1特异性地结合于BRD7该启动子区;Sp1特异性阻断剂mithramycinA能明显地抑制BRD7启动子的活性和BRD7基因的表达.     

大鼠Mettl9基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆大鼠Mettl9基因,并构建慢病毒表达载体,为研究Mettl9基因功能奠定基础。方法:提取原代培养大鼠星形胶质细胞的总RNA,应用RT-PCR方法,扩增出Mettl9基因的cDNA,克隆至pGEM-T载体上并测序;再将该基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP,测序鉴定,利用脂质体lipofectamine 2000转染至293T细胞进行包装,感染U251细胞,荧光显微镜下观察其表达。结果:Mettl9 cDNA的RT-PCR扩增产物为954 bp的基因片段,连接到pGEM-T载体后测序结果向GenBank递交获得收录号HQ898855;构建的pLen-ti6.3-Mettl9-IRES-EGFP慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度达1.825×108TU/mL;经感染U251细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光。结论:成功克隆了SD大鼠Mettl9基因,构建了该基因的慢病毒表达载体pLenti6.3-Mettl9-IRES-EGFP。