毛竹不同截短U3启动子的克隆及表达分析

具有明确转录起始位点的U3和U6启动子是CRISPR/Cas9技术中驱动sgRNA转录的重要元件。从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了2个PeU3启动子, 均进行了3个不同长度的截短, 长度分别为550、397和149 bp及561、392和152 bp; 并分别构建6个启动子驱动的GUS及LUC植物表达载体, 再利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法分别转化麻竹(Dendrocalamus latiflorus)愈伤组织和烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。结果显示, 这些PeU3启动子总体都具有转录活性, 不同PeU3启动子以及同一PeU3启动子不同截短时其转录活性不同, 其中长度为397 bp的PeU3-1-2pro启动子活性最强, 可为构建竹子CRISPR/Cas9基因组编辑体系提供更多理想的内源启动子。     

人源STK3蛋白截短突变体的克隆、表达及纯化

人源STK3蛋白(serine/threonine-protein kinase 3)是一种促凋亡激酶,能与多种肿瘤相关蛋白相互作用,主要功能为应激活化,能入核介导染色质凝集,导致核小体间DNA碎片化.为了进一步研究STK3蛋白结构与功能,对其进行了克隆、蛋白提取及纯化.由于在表达全长STK3蛋白时很难获得可溶性表达蛋白,基于此蛋白序列特点设计了6个STK3蛋白截短突变体,对其进行克隆、表达及纯化,最终得到了纯度较高的STK3蛋白C端截短突变体(327-491),为下一步进行蛋白结晶和结构测定奠定基础.     

白桦BpJMJ18基因启动子克隆及表达分析

为探究BpJMJ18基因在植物生长发育过程中的功能，本研究利用PCR技术克隆白桦（Betula platyphylla）BpJMJ18基因的启动子，通过生物信息学分析发现，该启动子序列中除了包含TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外，还具有光响应元件和多种激素应答相关的元件；进而构建植物表达载体pBI101-BpJMJ18pro：：GUS，并用农杆菌介导的瞬时转化法侵染白桦，对转基因株系进行GUS染色分析，结果发现BpJMJ18基因启动子能够驱动GUS基因在白桦的主根、侧根、根尖、叶片的维管束和嫩茎中均检测到表达。上述结果说明白桦BpJMJ18启动子具有启动活性，可能影响植物的生长发育。     

大鼠NKx6.1启动子克隆及特异性表达分析

旨在构建大鼠NKx6.1启动子的报告载体,验证转录因子T3R对NKx6.1启动子的调控活性。用PCR扩增大鼠脑组织NKx6.1的5'上游启动子片段2.4 kb,应用生物信息学方法预测该片段上潜在的转录因子T3R结合位点,根据不同的结合位点作系列截短,获得3段长度不等的启动子缺失片段,分别克隆到荧光素酶报告基因表达质粒(p GL3-Basic)上,构建相应的报告载体。将报告载体和T3R共转染大鼠星形胶质细胞(rat astrocytes,RA),并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示,成功构建大鼠NKx6.1启动子报告载体,双荧光素酶报告基因活性检测表明T3R对NKx6.1启动子有明显调控作用,其中-1 887 bp-1 507 bp活性最高,即存在关键顺式调控元件。克隆并筛选出启动子核心区域,揭示了甲状腺激素对大鼠NKx6.1的表达调控机制。     

白桦BpSPL2基因启动子的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的转录因子,研究表明其在参与发育阶段转变、花和果实发育等方面起着重要作用。利用PCR技术从白桦基因组DNA中扩增获得BpSPL2基因上游1 960 bp启动子序列,使用PLACE和Plant CARE在线软件分析序列,发现BpSPL2基因启动子序列中含有与开花、非生物胁迫及激素响应等相关的顺式作用元件,暗示其在植物的生长发育和胁迫应答中起重要作用。进而构建了BpSPL2基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,并利用农杆菌介导将其瞬时转化至白桦和拟南芥,通过GUS组织化学染色检测BpSPL2基因启动子的组织表达特性,结果表明BpSPL2基因启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦和拟南芥中表达;而其表达活性在白桦的叶片、芽及根部中较强,在拟南芥的花药、雌蕊和叶片较强,为进一步研究白桦BpSPL2基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

水稻OsHAK26启动子的克隆及瞬时表达分析

对水稻KT/HAK/KUP钾离子转运蛋白家族OsHAK26起始密码子上游2 064bp序列进行分析,发现该序列除了具备TATA-Box、CAAT-Box等基本启动子元件外,还含有许多发育、激素、非生物胁迫等响应元件以及KT/HAK/KUP家族启动子普遍存在的元件。用该片段及5'端缺失的-1 473bp、-963bp、-441bp、-193bp四个片段分别取代植物瞬时表达载体pBI-221的CaMV35S启动子区域,并利用拟南芥叶肉原生质体进行瞬时表达分析。结果表明,这五种片段都具有一定的启动活性,随着长度减小,活性下降,但缺失-963bp~-441bp之间的片段却导致活性显著回升,推断该区段含有抑制元件,缺失-441bp~-193bp之间的片段导致活性大幅下降,推断-441bp~-193bp为OsHAK26基因启动子的核心启动区域。     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

葫芦藓LEAFY基因和启动子的克隆及表达分析

本研究以孢子植葫芦藓为试验材料,采用Tail-PCR与RT-PCR相结合的方法克隆得到葫芦藓LFY基因(FhLFY)的完整片段,该基因DNA全长为2 527bp,包含4个外显子和3个内含子序列,有1个1 050 bp的完整开放阅读框,编码349个氨基酸.通过Tail-PCR技术克隆得到905 bp的FhLFY基因启动子...     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

杆状病毒SpltMNPV ORF124基因截短片段的克隆与表达

目的:克隆并表达斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodotura litura mulfieapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF124基因的部分编码序列.方法:用PER方法扩增目的基因序列片段,并将其克隆至原核表达载体pQE-30上,转化到Escherichia.coli M15[pREP-4]中进行诱导表达.结果:构建了pQE-tr124原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达了一个与预期理论值相符的约为33kDa的蛋白.以Ni2+-NTA偶连抗体检测证明所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白.结论:成功表达了SpltMNPV ORF124的部分编码序列,该融合蛋白的成功表达为进一步深入研究基因的功能奠定了基础.     

草莓MET1基因启动子克隆及瞬时表达分析

根据草莓MET1类DNA甲基转移酶基因(FaMET1)全长序列设计引物,通过PCR获得了该基因翻译起始位点上游669 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列中存在启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box和多个胁迫诱导元件.进一步构建了FaMET1基因启动子驱动GUS的植物表达载体FMpro::GUS,通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,结果表明,该序列能够驱动GUS在草莓果实中瞬时表达,为进一步研究FaMET1的表达调控奠定了基础.     

截短的HCV NS3蛋白的表达、纯化及应用

目的:为了发展新一代HCV检测试剂盒,使包被的NS3蛋白能提高其检测的精确度与准确度.方法:通过生物信息学方法选定目标蛋白为HCV1263a.a～1583a.a,应用PCR方法克隆出编码此部分NS3蛋白的DNA序列,连接到表达载体pQE30构建重组子pQNS3,转化工程菌株JM109后诱导表达,表达产物通过Western-blot实验证实,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化,采用ELISA方法检测纯化的蛋白在免疫检测中的应用.结果:工程菌株在IPIG诱导下表达出N端含6个组氨酸的NS3融合蛋白,分子量约为36kDa,利用纯化的目标蛋白对40份HCV抗体阳性参考品,蛋白检测的符合率为77.5%(31/40);对40份阴性参考品,检测符合率为97.5%(39/40).结论:表达的NS3融合蛋白,具有很好的应用价值,可以应用于新一代HCV检测试剂盒以及对NS3蛋白功能的研究.     

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到pGPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明：全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。     

苹果MAX1基因的克隆和表达及启动子分析

MAX1(MORE AXILLARY GROWTH1)是独脚金内酯(Strigolactones,SLs)合成途径中的关键基因,为了研究MAX1在苹果分枝调控中的功能,以苹果‘长富2号’(Malus domestica‘Nagafu 2’)腋芽为材料,采用PCR方法,克隆MdMAX1基因,进行生物信息学和表达水平分析;采用瞬时表达转化烟草,进行GUS染色,分析MdMAX1启动子活性。结果表明:(1)成功克隆得到苹果MAX1,其开放阅读框(ORF)1620 bp,编码539个氨基酸;系统进化和基序分析表明,MdMAX1和已知的A1型MAX1相似。(2)qRT-PCR分析表明,MAX1基因在‘长富2号’嫁接苗茎中高表达,并在腋芽本身有表达;RNA-seq分析表明,细胞分裂素(6-BA)处理苹果腋芽96 h后MAX1基因的表达水平显著降低。(3)成功克隆获得‘长富2号’MAX1启动子序列片段(1500 bp),顺式作用元件预测显示MdMAX1启动子序列中存在光响应元件,GUS活性分析表明光照处理能够减弱MAX1启动子的活性。该研究为进一步研究苹果MAX1参与SLs合成、调控苹果分枝的功能奠定了基础。     

烟草花药特异表达基因启动子的克隆及序列分析

通过PC,R扩增,从烟草(Nicotiana tabacum cv.NC89)中克隆了花药绒毡层中特异表达基因的启动于,序列分析表明,该启动子含1303个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．4％。     

水葫芦EcGS1b基因启动子的克隆及表达分析

利用染色体步移技术从水葫芦基因组DNA中扩增得到谷氨酰胺合成酶EcGS1b基因5'端上游约1.7 kb的一段序列,经PlantCARE序列分析表明,该序列中除了包括TATA-box和CAAT-box等基本元件外,还含有TATC-box、HSE、LTR和多种光反应相关的元件,初步推测其为EcGS1b基因启动子,命名为pEcGS1b。进一步通过PCR扩增了4个5'缺失的pEcGS1b片段,命名为p1200、p900、p600、p400。以pBI121为基础,构建了4个以GUS为报告基因的植物表达载体,命名为p1200::GUS、p900::GUS、p600::GUS、p400::GUS。利用农杆菌介导的叶盘法将4个植物表达载体转化烟草叶片,进行瞬时表达。结果表明4个缺失片段均具有启动功能,但弱于组成型表达的花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子,其中p1200的启动活性最强。     

甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及初步分析

甘蔗茎秆是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在甘蔗茎秆中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,茎秆特异性启动子的获得是甘蔗作为生物反应器的前提。利用染色体步移法克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a 5′端上游的一段长1968bp的序列（ Ppst2a ）,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体,命名为pCAMBIA1900,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化甘蔗的茎和叶,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的己糖转运蛋白基因启动子只在甘蔗茎中驱动gus基因瞬时表达,该启动子具有茎秆特异性。     

苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。     

拟南芥AtNHX2启动子的克隆及表达模式分析

AtNHX2基因是拟南芥NHX基因家族的一员,编码了一种液泡膜中的Na+/H+反向运输体并对拟南芥的耐盐能力起着重要的作用.采用PCR扩增的方法克隆了拟南芥AtNHX2基因启始密码子上游约2.8kb的DNA片段,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301-1中,通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达的方法,初步检测启动子的活性.将重组质粒pCAMBIA1301-1/AtNHX2 promoter转化拟南芥并筛选纯合子.AtNHX2 promoter-GUS分析显示AtNHX2在所有的组织中均有表达,包括根尖.在保卫细胞中检测到了强烈的GUS表达,这一结果表明,AtNHX2对特殊细胞的pH调控和K+自身稳定方面起着重要的作用.AtNHX2启动子的活性可被NaCl抑制,并且抑制的强度和NaCl的浓度成正相关.300 mmol/L KCl处理可增强启动子的活性,说明NaCl和KCl是在转录水平上调控AtNHX2的表达.在老叶中GUS活性比在新叶中GUS活性强,这说明了AtNHX2优先将有毒的离子积累在老叶中,从而有利于植物的正常发育.在根毛细胞中也观测到了强烈的GUS活性,这就暗示了AtNHX2在扩大的液泡中储存Na+.     

毛竹漆酶基因PeLAC的克隆与表达分析

漆酶（LAC）对植物生长发育具有重要作用。本研究以毛竹（Phyllostachys edulis（Carr.） Lehaie）为实验材料,克隆获得毛竹漆酶基因PeLAC的cDNA和基因组序列,长度分别为1692bp和2785bp。该基因包含5个内含子和6个外显子;PeLAC蛋白编码563个氨基酸,推测的分子质量和等电点分别为62.3kD和9.056。系统进化分析表明,PeLAC与其它植物的漆酶具有较高的一致性。经预测PeLAC基因编码序列中含有miR397的靶点,利用RLM-5'RACE技术证明miR397对PeLAC能够准确切割,位点位于靶序列的第10~11位碱基之间。组织特异性分析表明,PeLAC基因在茎中表达丰度最高,根中次之,叶鞘中较少,叶片中几乎未检测到表达;随着笋高度的增加,PeLAC表达丰度上升,生长至15cm时达到最大值,30cm时又有所下降;而miR397的表达与PeLAC相反。本研究同时克隆了PeLAC基因上游启动子序列PeLACp,其包含ABRE、MBS等多种与逆境胁迫相关的响应元件。利用ABA（100μmol/L）和NaCl（400mmol/L）溶液处理可明显诱导PeLAC在毛竹根中表达,而GA₃（100μmol/L）处理则对其表达具有抑制作用。