苦荞R2R3-MYB转录因子调控原花青素生物合成的研究

基于苦荞花期转录组数据,该研究筛选并克隆获得一个黄酮代谢相关的MYB类转录因子,并命名为FtMYB23。该基因ORF框长879bp,编码292个氨基酸;系统进化树分析显示,FtMYB23与SG5-MYB亚家族成员聚为一簇,属于典型的R2R3-MYB型转录因子。β-半乳糖苷酶滤纸分析表明,其具有转录激活活性。FtMYB23过表达转基因拟南芥株系的表型分析表明,3个阳性株系的种皮颜色均呈现出比野生型更深的褐色,其叶中原花青素含量均极显著增加(P 0.01),分别为野生型的4.68、3.5和2.8倍。qRT-PCR分析表明,转基因拟南芥中黄酮合成相关的AtCHS、AtCHI、AtF3H、AtF3′H、AtFLS、AtDFR和AtBAN等基因的表达量显著升高(P 0.05),而AtTT12的表达量极显著降低(P 0.01)。研究认为,FtMYB23作为典型的Subgroup5-MYB(SG5-MYB)激活型转录因子,通过促进黄酮合成途径早期关键酶基因的表达,从而提高原花青素的合成与积累。     

虎杖转录因子PcMYB2的表达特性和功能分析

对虎杖R2R3-MYB转录因子PcMYB2进行转录活性鉴定和表达特性分析,并在转基因拟南芥和转基因毛状根中进行功能研究。利用酵母单杂交试验分析PcMYB2的转录活性;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测虎杖中PcMYB2的表达模式;DMACA法检测PcMYB2转基因拟南芥和虎杖毛状根中的原花青素含量。酵母单杂试验表明,PcMYB2具有转录激活活性;RTqPCR结果显示,PcMYB2在虎杖根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高,并且ABA和H₂O₂外源处理可诱导叶片中PcMYB2的表达;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥种皮颜色加深,原花青素含量为野生型的1.8倍;与野生型毛状根相比,转基因毛状根DMACA染色更深,原花青素含量为野生型的2.3倍。PcMYB2具有转录激活活性,且促进植物原花青素的生物合成。     

中国水仙NtMYB7基因的克隆及功能初步研究

为研究中国水仙类黄酮代谢调控网络,从中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)中克隆得到一个R2R3-MYB基因,命名为NtMYB7(GenBank登录号:MF522208)。序列分析表明,NtMYB7基因cDNA开放阅读框(ORF)为753bp,编码250个氨基酸。氨基酸多重序列比对分析发现,NtMYB7含有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB家族;系统进化树分析结果显示,NtMYB7与花青素合成抑制因子聚为一类。实时荧光定量PCR分析发现,NtMYB7基因在中国水仙不同时期花瓣和副冠以及不同器官中均有表达,且NtMYB7基因在鳞茎盘中表达量最高。瞬时表达分析发现,NtMYB7使花青素合成激活因子StMYB诱导产生的红色变浅;定量PCR分析表明,NtMYB7基因显著抑制烟草黄酮醇代谢分支FLS基因的表达,同时抑制StMYB激活的花青素和原花青素合成结构基因的表达。研究结果初步判断,NtMYB7基因是中国水仙类黄酮代谢途径的抑制因子。     

TrMYB308基因的克隆及在苦荞毛状根中的功能分析

MYB类转录因子广泛参与调控植物的生长发育过程,对植物次生代谢也具有重要调控作用。前期研究以V型紫斑白三叶为材料,通过RNA-Seq技术,筛选出与类黄酮合成相关的转录因子TrMYB308。在此基础上从V型紫斑白三叶中克隆出TrMYB308基因,该基因的ORF全长为921 bp,编码306个氨基酸。亚细胞定位结果表明,TrMYB308定位于细胞核。多序列比对和系统发育分析表明,TrMYB308属于典型的R2R3-MYB转录因子,且该蛋白与红三叶TaMYB308和苜蓿MtMYB308等蛋白亲缘关系较近。表达特性分析结果表明,Tr MYB308基因在紫斑白三叶各个组织中均有表达,且其表达量受JA的诱导。在苦荞毛状根中异源表达TrMYB308,结果发现转基因根系中的类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如FtF3H和FtFLS)的表达量明显增加;转基因根系总黄酮的含量明显高于对照组。基于以上结果,推测TrMYB308可能参与类黄酮次生代谢生物合成调控。本研究为荞麦类黄酮合成分子机制探索及荞麦品质改良提供了理论依据。     

中间锦鸡儿CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢

目的:R2R3-MYB类转录因子参与调控植物初生和次生代谢。方法:从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)干旱转录组数据库中搜索并克隆了一个R2R3-MYB基因,命名为CiMYB15(GenBank登录号MH678649);将CiMYB15基因编码区转入野生型拟南芥中,利用分光光度法测定了野生型和转基因拟南芥中总黄酮含量,并用qRT-PCR检测了转基因植物中At CHS基因的表达情况。同时采用染色体步移法克隆了CiMYB15基因的启动子序列。结果表明:(1) CiMYB15基因g DNA长度为1 960 bp,包含三个外显子(134、131和521 bp)和两个内含子(281和893 bp);开放阅读框长度为786 bp,编码262个氨基酸。(2)克隆得到1 580 bp的启动子序列,序列中主要包含损伤诱导元件G-box和P-box、盐诱导作用元件GT1-motif、参与干旱诱导的反应元件MBS,以及真菌侵害应答元件BOX-W1、植物-病原菌互作元件EIER;此外,还包含调节黄酮合成基因的MYB转录因子的结合位点。(3) CiMYB15基因的表达受到紫外胁迫的诱导。(4) CiMYB15基因过表达株系的总黄酮含量高于野生型。(5)过表达植物中At CHS基因的表达量亦高于野生型。以上结果说明,CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢。     

苦荞转录因子FtMYBF的克隆、亚细胞定位及表达分析

R2R3-MYB转录因子SG7亚家族成员在植物黄酮醇生物合成中具有极其重要的调控作用.探究苦荞中SG7 R2R3-MYB转录因子在黄酮醇生物合成中的功能,为苦荞黄酮醇生物合成的分子调控机制研究奠定基础.采用RT-PCR技术从苦荞中克隆到一个前期经转录组与代谢组联合分析鉴定到的SG7 R2R3-MYB转录因子,命名为Ft...     

R2R3-MYB转录因子PnMYB1调控三七皂苷生物合成

旨在明确PnMYB1转录因子对三七皂苷生物合成具有调控作用。利用RACE技术获得PnMYB1基因全长,对PnMYB1进行系统发育树分析;构建PnMYB1植物过表达载体并侵染三七细胞,检测转基因三七细胞中人参皂苷R1、Rg1、Re、Rb1和Rd的含量;将PnMYB1与鲨烯合酶(PnSS)、鲨烯环氧化酶(PnSE)、达玛烯二醇合成酶(PnDS)和环阿屯醇合成酶(PnCAS)等参与三七皂苷生物合成途径的关键酶的基因启动子共转染烟草叶片,进行瞬时表达分析,利用GUS表达系统验证PnMYB1转录因子能否与三七皂苷生物合成关键酶基因的启动子相互作用。结果显示,PnMYB1转录因子属于R2R3-MYB家族;在过表达PnMYB1的三七细胞中,五种重要三萜皂苷在转基因细胞中均有不同程度的增加,进一步分析证明PnMYB1转录因子通过激活PnSE和PnDS的启动子,促使PnSE和PnDS的表达水平显著升高,进而实现对三七皂苷生物合成的调控。PnMYB1转录因子可以同时调控三七皂苷生物合成途径中两个关键酶基因的表达,从而影响三七皂苷的生物合成。     

葡萄风信子MaMYB114基因克隆及功能研究

MYB转录因子在植物花青素生物合成过程中发挥主要调控作用。为探究MYB转录因子在葡萄风信子(Muscari spp.)蓝色花色形成中的作用，研究以葡萄风信子‘亚美尼亚’为试验材料，基于课题组前期转录组数据库深度挖掘，经本地Blast比对分析，采用RT-PCR方法克隆获得1个R2R3-MYB基因，命名为MaMYB114(GenBank登录号：OQ615377),对其进行生物信息学分析和异源转化烟草功能验证。结果表明，(1)MaMYB114开放阅读框全长为714 bp,编码237个氨基酸；MaMYB114蛋白含有R2R3保守结构域，属于R2R3-MYB家族AN2亚家族。(2)亚细胞定位及转录自激活结果显示基因定位于细胞核，且具有转录自激活活性，符合转录因子一般特征。(3)实时荧光定量分析显示MaMYB114基因主要在花中高表达，表达模式具有组织特异性。结合不同时期花青苷含量变化模式，发现MaMYB114在着色期花青素含量高的花蕾中高表达，表明MaMYB114可能参与了葡萄风信子花青苷合成过程。(4)过表达MaMYB114促进烟草花青苷积累，表明MaMYB114正向调控花青素合成。本研究表明...     

小麦R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4D的克隆及功能分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物各种生理生化过程。该研究通过对小麦基因组测序数据库进行同源搜索,利用电子克隆技术从紫色籽粒小麦品种‘高原115’中分离得到了一个新的MYB基因TaMYB3-4 D。结果表明,TaMYB3-4D仅含有一个内含子,其编码蛋白含有2个连续的MYB结构域,为典型的R2R3-MYB蛋白。TaMYB3-4D系统发生关系上与调控花青素合成的MYB基因亲缘关系较近。TaMYB3-4 D与bHLH基因ZmR瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。此外,TaMYB3-4 D基因仅在‘高原115’含花青素的种皮和胚芽鞘中表达,在根、茎、叶中均未表达。研究表明,TaMYB3-4 D基因是一个具有调控花青素合成代谢功能的R2R3-MYB基因,很有可能参与小麦花青素的生物合成。     

不同红梨果皮类黄酮合成基因表达模式分析

采用半定量和荧光定量PCR方法,分析10个类黄酮合成基因在梨品种‘红星’和‘满天红’成熟果皮中的转录特性以及光照对基因表达的影响.结果表明:‘满天红’花色苷合成上游基因(CHS、CHI)的表达量高于‘红星',而下游基因(F3H、DFR、ANS)以及黄酮醇(FLS)和原花色素(LAR、ANR)合成相关基因的表达量却正好相反.套袋去除光照可使所有被检测基因的转录水平降低,F3GT和FLS最明显,表达量差异达20～30倍以上,且套袋‘红星’中PAL、F3H、DFR、ANS、LAR、ANR基因的表达量仍高于不套袋‘满天红’.研究认为,花色苷合成下游基因转录水平的差异是2个红色梨品种间着色不同的主要原因,而F3GT是光照调控‘红星’着色的关键基因.     

药用植物长春花WRKY转录因子的鉴定及表达谱分析

WRKY是调控植物生长发育和逆境胁迫反应等生命活动的一个转录因子大家族.然而,有关药用植物长春花CrWRKY转录因子的种类和功能却知之甚少.从26 009个长春花蛋白中鉴定出47个CrWRKY转录因子.依据WRKY结构域和系统进化,将CrWRKY分为G1、G2和G3三大类群.表达谱数据分析表明,长春花CrWRKY基因的表达具有器官特异性.47个CrWRKY基因的表达谱可分为3种表达模式:第1类型主要在花、甲基茉莉酸甲酯(MeJA)或酵母提取物(YE)处理的原生质体中高表达;第2类型主要在茎和毛状根中高表达;第3类型在根、茎、叶、幼苗和MeJA处理的毛状根中高表达.进一步用实时定量PCR检测了16个代表性CrWRKY基因在不同器官、MeJA处理原生质体和毛状根中的表达模式,检测结果与上述数字基因表达谱数据基本一致.约1/3以上CrWRKY基因的表达受MeJA和YE的调控,暗示它们可能参与萜类吲哚生物碱的合成和逆境胁迫反应.为进一步解析长春花WRKY转录因子的功能和萜类吲哚生物碱合成调控的网络奠定了基础.     

中国野生毛葡萄VqTLP15基因的克隆与抗病性功能研究（英文）

该研究以抗病品种中国野生毛葡萄‘商-24’和感病品种欧洲葡萄‘红地球’为材料,利用RT-PCR方法克隆TLP15基因,分别命名为VqTLP15和VvTLP15(GSVIVT01018769001),对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转化拟南芥,并接种不同病原菌观察分析转基因株系的抗性,采用qRT-PCR检测SA和JA/Eth信号途径以及调控气孔运动的相关基因表达。结果显示:(1)成功克隆获得VqTLP15基因的开放阅读框(ORF);氨基酸序列比对显示,VqTLP15基因与葡萄基因组网站欧洲葡萄‘黑比诺’VvTLP15和‘红地球’克隆的VvTLP15基因的同源性分别为98.99%和99.66%。(2)亚细胞定位表明,VqTLP15定位于细胞质。(3)成功获得VqTLP15转基因拟南芥株系(L1、 L2、 L3)。(4)接种观察发现:白粉菌处理7 d后转基因株系对白粉菌的抗性较野生型(Col-0)提高,且其叶片的白粉菌孢子浓度显著低于Col-0;灰霉菌诱导的叶片坏死性损伤在转基因株系(L1、L2和L3病斑面积40%的比例分别为71%、62%和67%)中显著大于Col-0(43%);接种PstDC3000后转基因株系叶片的病害表型没有Col-0明显,叶片孔径减小程度大于Col-0,且细菌浓度低于Col-0。(5)组织化学染色分析表明:白粉菌处理后转基因株系叶片胼胝质沉积、细胞死亡率和■水平都显著大于Col-0;灰霉菌处理后转基因株系的细胞死亡率、H_2O_2和■水平均高于Col-0;PstDC3000处理后细胞死亡率和■积累水平都高于Col-0。(6)qRT-PCR检测显示:接种白粉菌后,转基因株系中PR1和ICS1的表达水平均升高,PR1表达在接种72 h时达到峰值,而ICS1在接种120 h时达到峰值,LOX3的表达水平逐渐降低,并于接种120 h时降至最低水平,但仍高于Col-0;接种灰霉菌后,转基因株系中PR1、NPR1和PDF1.2基因的表达均上调,并在接种48 h时达到峰值,LOX3基因的表达水平下降,但仍高于Col-0;接种PstDC3000后,转基因株系中PR1、PDF1.2和NHL10的表达均高于Col-0,但WRKY53的表达低于Col-0, L1中COI1、FRK1、ATPPC2、FLS2、OST1的表达水平高于Col-0;接种flg22或LPS后, L1中COI1基因的表达低于Col-0,但ATPPC2、FLS2、OST1基因的表达水平高于Col-0。研究表明,过量表达VqTLP15基因降低了对白粉菌和PstDC3000的敏感性,增加了对灰霉菌的敏感性。VqTLP15基因可能通过介导水杨酸(SA)和茉莉酸/乙烯(JA/Eth)信号转导途径以及气孔免疫反应来参与植物的抗病防御反应,为葡萄抗病分子育种提供了一个可能的候选基因。     

金鱼草RADIALIS-like 1基因克隆与功能研究

MYB是植物中最大的转录因子家族之一，其中R3-MYB转录因子RADIALIS(RAD)在金鱼草(Antirrhinum majus)花发育过程中具有十分重要的作用。本研究对金鱼草基因组进行分析，发现1个与RAD结构相似的R3-MYB基因，将其命名为AmRADIALIS-like 1(AmRADL1)。进一步通过生物信息学预测基因功能，利用qRT-PCR分析AmRADL1在野生型金鱼草不同组织器官中的相对表达量，对过表达AmRADL1的转基因金鱼草进行形态学观察和组织学染色分析。结果表明，AmRADL1基因开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为306 bp，编码101个氨基酸，具有典型的SANT结构域，C末端含有CREBmotif，与番茄(Solanum lycopersicum)SlFSM1同源性较高。qRT-PCR结果表明，AmRADL1在根、茎、叶和花中均有表达，其中在花中表达量较高；进一步分析其在不同花器官中的表达量差异，发现AmRADL1在心皮中表达最高。转基因金鱼草植株的组织学染色分析结果显示，与野生型相比，转基因植株的心皮细胞大小没有明显的变化，...     

RsICE1基因表达和转基因水稻抗冷通路研究

以萝卜幼苗和水稻T1代转RsICE1基因(从抗寒萝卜植株中分离的一个编码碱性螺旋-环-螺旋低温胁迫转录因子,HQ891287)株系为材料,通过半定量RT-PCR及实时定量PCR等方法,分析RsICE1基因的表达、水稻转基因株系中RsICE1基因的遗传及冷诱导基因的表达情况.结果显示:(1)半定量RT PCR分析表明,RsICE1基因在萝卜的根、茎、叶中为组成型表达,在幼苗根和茎中表达量较强;RsICE1基因的表达水平能够被冷处理和NaCl处理诱导上调表达,但ABA和脱水处理无上调作用.(2)卡方测验表明,水稻转基因T1代潮霉素抗性发生了3∶1分离模式;Southern和Northern杂交结果表明,4个抗冷转基因株系中RsICE1基因均以单拷贝、单位点整合到水稻基因组并正常表达.(3)实时定量PCR分析表明,冷胁迫下,RsICE1基因超表达但对水稻OsDREB1A(AF300970)、OsDREB1B(AF300972)、OsDREB1F(AY785897)基因表达没有影响,表明RsICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响不依赖OsDERB1冷反应通路.     

培养基种类对花生毛状根株系生物量和白藜芦醇含量的影响

旨在研究不同培养基对花生毛状根株系生物量和白藜芦醇含量的影响。利用发根农杆菌R1601侵染花生的叶片,诱导毛状根,利用PCR技术检测毛状根。使用5种培养基(1/2MS、MS、MS+500 mg/L羧苄西林钠、B5和N6)分别培养同一个株系的花生毛状根,4周后利用高效液相色谱法(HPLC)测量毛状根生物量和白藜芦醇含量。结果显示,不同培养基对花生毛状根株系生物量的积累有显著差异,1/2MS培养基和MS培养基有利于花生毛状根株系生物量的积累。不同培养基对花生毛状根株系中白藜芦醇的含量有显著差异,B5培养基和N6培养基有利于花生毛状根株系中白藜芦醇的积累。     

毛竹MYB转录因子PeMYB2的克隆与功能分析

MYB类转录因子在调控逆境应答基因的表达起着重要的作用, 是最大的植物转录因子之一。文章通过同源基因克隆方法和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术, 以毛竹幼苗为材料, 获得一个MYB类转录因子, 命名PeMYB2。氨基酸序列分析表明, PeMYB2具有典型的R2R3-MYB特征, N端含有两个串联重复保守结构域, C端含有一个膜蛋白DUF3651; 进化树分析表明, PeMYB2与水稻OsMYB18序列相似性最高, 达到85.98%; 酵母单杂实验表明, PeMYB2具有转录激活功能。将PeMYB2转化拟南芥对其功能进行分析, 获得7株转基因纯合体植株。比较转基因和野生型拟南芥表型发现, PeMYB2的过量表达使转基因拟南芥出现矮化、晚花的现象; 非生物胁迫处理(盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫)结果表明, 转基因拟南芥中PeMYB2的过量表达, 导致转基因植株对盐胁迫和低温胁迫有更高的耐性, 但是对低温胁迫的耐受性没有明显的变化; 进一步通过盐胁迫信号通路相关Marker基因(NXH1、SOS1、RD29A、COR15A)的定量PCR实验验证, 发现PeMYB2对下游这些抗逆基因的表达具有调控作用。上述实验结果表明, 毛竹PeMYB2可参与非生物胁迫调控, 对毛竹盐胁迫和低温胁迫的响应起着重要的作用。     

彩叶桂(Osmanthus fragrans)品种‘虔南桂妃’叶片红色消退过程中的转录组分析

彩叶桂(Qsmanthus fragrans)叶片发育不同时期色泽变化具有显著差异,但目前对于其内在的分子调控机制尚不清楚。本研究利用彩叶桂品种‘虔南桂妃’红色(R)、黄绿色(YG)和绿色(G)叶片进行高通量测序,以期在转录组水平上解析叶色变化的潜在原因。通过系统分析转录组数据,共得到36.66 Gb的碱基数据,检测出32 252个新转录本。在R-vs-G、R-vs-YG和YG-vs-G比较组中共筛选到23 954个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中包含57类共3 308个转录因子家族成员,且下调表达的差异基因数目大于上调表达的基因数目。KEGG和GO功能分析表明,差异表达基因主要与“催化活性”、“细胞”和“代谢”等生物学功能相关。此外,筛选到了6个类黄酮生物合成途径上显著差异表达的基因,分别编码查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、UDP-糖基转移酶(UGT)、黄酮醇合成酶(FLS)和花青素合成酶(ANS)。与红色叶片相比,这些基因的表达量在黄绿色和绿色叶片中显著降低。推测下调表达的...     

花青素合成途径中分子调控机制的研究进展

花青素是广泛存在于植物中的天然水溶性色素。植物不同物种中花青素生物合成代谢途径的遗传特性和调控机制决定了该物种的花色。目前花青素生物合成途径的研究已清晰透彻。花青素合成途径的调控主要发生在结构基因的转录水平上,受多种转录因子的调控。研究发现,对花青素代谢途径中结构基因起调控作用的重要转录因子,主要包括WD40重复蛋白、b HLH蛋白和R2R3-MYB蛋白,这些转录因子之间的结合及其相互作用决定结构基因的表达。本文着重介绍花青素生物合成途径的分子调控机制,即转录因子通过形成三聚体复合物,与结构基因的启动子结合来调控结构基因的表达,并概述其在花色改造基因工程及定向改变花青素含量中的应用。     

丹参多酚氧化酶基因的克隆及表达分析

前期研究发现多酚氧化酶(PPO)能正向调控丹酚酸B合成,该研究运用RACE技术,从丹参毛状根中克隆到多酚氧化酶基因(SmPPO,GenBank登录号为KF712274)全长序列,其cDNA全长1 930bp,开放阅读框为1 770bp,编码589个氨基酸。将SmPPO与管状花目其它4个物种进行氨基酸序列比对,在N端类囊体转移结构域中发现都存在2个N-豆蔻酰化位点。在丹参毛状根培养液中加入不同诱导因子,利用实时荧光定量PCR检测,发现该基因在酵母提取物处理中表达量显著上调,但在银离子、抗坏血酸和L-半胱氨酸处理中表达受到明显抑制。运用HPLC技术同步检测毛状根中丹酚酸B含量,显示出与基因表达相同的变化趋势。研究表明,丹参中多酚氧化酶基因(SmPPO)对丹酚酸B的合成具有正向调控作用。     

反义trxs基因对转基因小麦种子内源trxh基因表达的影响

以转反义硫氧还蛋白基因(anti-trxs)株系01TY70-1-17-5及其对照小麦品种‘豫麦70’为试验材料,以小麦中稳定表达的肌动蛋白基因actin为内标,用半定量反转录聚合酶链式反应(semi-QRT-PCR)方法,对转基因株系及其对照种子中trxh基因时空表达情况进行了检测。检测结果表明,花后15~30d转基因株系trxh基因转录量平均比对照下降了20.1%,花后25d显著低于对照(P<0.05);胚乳trxh基因转录量最低,平均比对照低19.4%;种子吸涨24h时间内,转基因株系trxh基因转录量较对照均略低,但差异不显著。表明,外源trxs基因的导入直接干扰了内源基因的表达。