染色质免疫共沉淀实验方法

染色质免疫共沉淀(ChIP)技术是一种检测蛋白质与DNA结合的实验技术。该方法可以先进行样品交联, 然后将蛋白质与DNA复合物进行随机DNA切断, 再借助免疫学方法特异性富集与目的蛋白相结合的DNA片段, 从而检测转录因子等目的蛋白质与DNA的结合情况, 鉴定基因启动子或其它DNA结合位点。该方法同时也可应用于研究基因组特定位点的组蛋白修饰情况。该文介绍了依赖交联固定的常规免疫共沉淀(X-ChIP), 以及适用于10³细胞级别微量实验材料的基于微球菌核酸酶非交联免疫共沉淀(ULI-NChIP)具体操作过程和注意事项。     

蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸相互作用研究方法及在人肠道病毒A71型研究中的应用

研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法主要有酵母双杂交、噬菌体展示、免疫共沉淀、谷光苷肽巯基转移酶沉淀、细胞内共定位、亲和印迹、病毒铺覆蛋白结合技术、表面等离子共振、荧光共振能量转移等技术。检测蛋白质-核酸相互作用的方法主要包括酵母单杂交、染色质免疫沉淀、电泳迁移率实验、DNA-蛋白质印迹、报告基因、免疫共沉淀、谷光苷肽巯基转移酶沉淀、噬菌体展示等技术。在我们实验室对人肠道病毒A71型(EV-A71)的研究中经常会用到这些方法,但在该研究领域尚未有中文综述发表,因此本文对EV-A71研究中这些方法的应用进行了综述,该综述对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸在其他病毒研究中的应用同样具有重要启示。     

蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸相互作用研究方法及在人肠道病毒A71型研究中的应用北大核心CSCD

研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法主要有酵母双杂交、噬菌体展示、免疫共沉淀、谷光苷肽巯基转移酶沉淀、细胞内共定位、亲和印迹、病毒铺覆蛋白结合技术、表面等离子共振、荧光共振能量转移等技术。检测蛋白质-核酸相互作用的方法主要包括酵母单杂交、染色质免疫沉淀、电泳迁移率实验、DNA-蛋白质印迹、报告基因、免疫共沉淀、谷光苷肽巯基转移酶沉淀、噬菌体展示等技术。在我们实验室对人肠道病毒A71型(EV-A71)的研究中经常会用到这些方法,但在该研究领域尚未有中文综述发表,因此本文对EV-A71研究中这些方法的应用进行了综述,该综述对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸在其他病毒研究中的应用同样具有重要启示。     

Reverse ChIP:研究DNA-蛋白质相互作用的新方法

反向染色质免疫共沉淀技术(reverse chromatin immunoprecipitation assay,Reverse ChIP)是一种在体内状态下分析DNA-蛋白质相互作用的新方法.它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质,蛋白质用质谱仪检测,以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的.其可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定,特别是寻找已知DNA元件相应的调节蛋白.在发现、鉴定靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA-蛋白质相互作用中有重要应用价值.     

检测DNA-蛋白质交联的新方法

将彗星实验进行改进以用于DNA-蛋白质交联作用的检测。利用甲醛对受试动物肝细胞的影响来判定此法是否适用于检测DNA-蛋白质交联。由于在实验中添加一定量的蛋白酶K, 可使单细胞在电泳时产生更大的迁移, 因此可以利用添加蛋白酶K前后的彗星尾距比来判断外来化合物对生物机体产生DNA损伤效应的时候是否有出现DNA-蛋白质交联作用。结果表明, 该方法快速、经济、灵敏度较高, 可以在单细胞水平对甲醛等强交联剂引发的不同组织的DNA-蛋白质交联效应进行检测, 希望该方法能成为指示DNA交联能力的有用工具。     

基于免疫共沉淀-液质联用技术的新型孕烷X受体配体检测方法的建立

目的:建立基于免疫共沉淀-液质联用技术的新型孕烷X受体(PXR)配体检测方法。方法:在HEK293细胞中转染带有Flag标签的PXR表达载体,裂解细胞后用偶联Flag抗体的微珠(beads)结合并分离细胞中表达的FlagPXR蛋白;以PXR的已知最为公认的配体/激动剂利福平为模型药物,配制1μmol/L利福平溶液,与结合有Flag-PXR蛋白的微珠孵育形成微珠-蛋白-利福平复合物;将微珠从体系中分离出来,用蛋白印迹实验检测复合物中的蛋白质,用液相色谱-质谱联用技术(液质联用技术)检测复合物中的利福平。在此基础上对利福平的作用进行验证,在肝细胞癌细胞Hep G2中检测系列浓度梯度的利福平对PXR转录因子活性的影响。结果:用免疫共沉淀技术从HEK293细胞中分离鉴定得到Flag-PXR蛋白;用液质联用技术检测到蛋白与小分子复合物中的利福平;利福平能够剂量依赖地诱导PXR的转录因子活性。结论:建立了基于免疫共沉淀-液质联用技术的新型PXR配体检测方法。     

用碱洗脱法检测DNA-蛋白质交联和DNA链间交联

本方法以DNA单链断裂的检测为基础,在背景γ射线照射下进行DNA交联检测。所建方法与Kohn氏原法相比,洗脱时间大为缩短,实验所用主要材料都能立足国内。本文引入“交联度”这个参数,能同时相对定量地表示DNA总交联、DNA-蛋白质交联和DNA链间交联。此外还从DNA、蛋白质两方面确证了DNA-蛋白质交联的存在。     

发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro

为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响。将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况。IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位。提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状。     

建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

目的：建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA（sRNA）提供体内验证方法。方法：首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA--RyhB1和RyhB2。结果：构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA--RyhB1和RyhB2。结论：建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。     

基于高通量测序技术检测全基因组DNA甲基化水平的方法

DNA甲基化的研究最近几年一直是表观遗传学研究的重点。有关DNA甲基化水平检测的方法大体上有十几种,随着第二代测序技术的发展,实现了在全基因组水平上对甲基化状态进行检测。目前,基于第二代高通量测序进行全基因组DNA甲基化水平检测的方法主要有BSP-seq(亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法)、Me DIP-seq(甲基化DNA免疫共沉淀测序法)、MBD-seq(甲基化DNA富集结合高通量测序法)。就这3种方法在原理、流程、优缺点、优化使用及后期需要用到的部分生物信息学资源等方面的研究进展作一综述,旨在为研究者在采用高通量测序方法研究DNA甲基化模式时提供一些思路。     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆生长;pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western印迹检测,可以检测到Myc-GINS2蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用.     

利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用

紫外交联免疫共沉淀(CLIP)技术能揭示RNA结合蛋白质在体内的RNA结合位点。将讨论该技术的基本原理和一些新的发展,这些新发展显著地提高了技术的特异性、灵敏度和应用范围。     

3种探究蛋白质互作实验技术简介

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的主要组成部分之一。目前实验室常采用酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术和免疫共沉淀技术研究蛋白质与蛋白质的相互作用情况。从实验技术的原理、基本步骤及其优劣性对上述3种经典且常用的筛选技术进行介绍。     

去泛素化酶USP10通过稳定Smurf1抑制TGF-β/BMP信号通路

目的 探究生理条件下去泛素化酶USP10调控的关键信号通路及分子机制。方法 利用GEO2R和Metascape对Usp10^+/+和Usp10^-/-新生小鼠肾组织基因芯片(GSE198574)差异表达基因和通路富集分析，使用免疫印迹实验和免疫组化技术检验核心转录因子的表达情况；进一步利用免疫印迹检测该信号通路，并通过基因芯片和免疫组化分析候选分子的表达情况；使用免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pull down实验验证USP10与候选分子的相互作用，通过泛素化实验明确USP10对底物分子的调控机制；利用免疫印迹检测细胞增殖、凋亡相关蛋白p21、Cleaved-caspase 3的表达情况，使用CCK-8和克隆形成实验分析USP10对细胞增殖的影响。结果 Usp10^-/-新生小鼠肾组织中TGF-β/BMP通路激活，USP10在小鼠体内缺失后导致Smad泛素相关因子1 (Smurf1)蛋白质水平降低，Smad1/5蛋白质水平上调，却不影响它们的转录水平；机制上，USP10与Smurf1存在相互作用，并依赖其去泛素化酶活性去除...     

启动子分析方法的研究进展

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,其结构与功能的研究是分子生物学的研究热点之一。对启动子与DNA结合蛋白的研究能从转录水平上阐明基因表达的调控机制,从而为更好地构建基因表达调控网络奠定基础,而且启动子与结合蛋白的研究能够帮助我们寻找新的蛋白质。近年来,启动子的研究方法日益增多,大多是借助于DNA和蛋白质相互作用的特性。本文从原核和真核启动子的基本结构、分类入手,对常用的和改进的几种启动子分析方法进行介绍。如生物信息学分析方法、酵母单杂交(Y1H)技术、瞬时转染法(Transient Transfection)、染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术、凝胶阻滞分析(EMSA)试验和DNA足纹(DNase I footprinting)分析法等,从原理、优缺点和最新应用等方面的研究进展进行了综述。对近年来出现的新技术新方法的应用前景作了展望,为启动子的结构与功能研究提供借鉴。     

一种微小染色质免疫共沉淀方法的建立

染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前研究蛋白与DNA相互作用的强有力的技术之一.然而传统的ChIP实验方法的最大缺陷是要求大量的细胞数,这限制了它应用于少量细胞数的样品.在传统ChIP实验的基础上综合国外文献建立了一种能在少量细胞样品中进行的染色质免疫共沉淀实验,称之为微小染色质免疫共沉淀(miniChIP).并通过对诱导前后的MEL细胞中表达的β珠蛋白基因簇组蛋白H4乙酰化(acH4)的研究,证实了其可靠性和特异性.结果显示:高敏位点HS2和活跃基因β-maj的启动子区域存在一定的组蛋白H4乙酰化水平,DMSO诱导后显著增加,而不活跃基因Ey的启动子区域则检测到极低水平的组蛋白H4乙酰化,且诱导后无明显变化.     

体内甲醛交联及染色质免疫沉淀--研究DNA和蛋白质作用的新方法

甲醛交联及染色质免疫沉淀作用研究体内DNA和蛋白质相互作用的一种新方法,在染色质结构研究中获得了广泛的应用。该方法利用甲醛固定活细胞中的DNA与蛋白质,通过免疫沉淀分离复合物,从而分析蛋白质及其体内的DNA结合序列。     

β-TC3细胞膜与胰岛素受体结合G蛋白的鉴定

目的:用免疫共沉淀的方法检测β-TC3(小鼠胰岛β细胞瘤细胞)细胞膜中与胰岛素受体结合的G蛋白.方法:提取β-TC3细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀及蛋白质印迹的方法,检测G蛋白α及β亚基的表达.结果:抗胰岛素受体抗体沉淀胰岛素受体结合的G蛋白复合物后,分别用抗胰岛素受体抗体、抗G蛋白α亚基抗体及抗G蛋白β亚基抗体,检测到胰岛素受体、G蛋白α亚基及G蛋白β亚基的表达.结论:在β-TC3细胞膜中,胰岛素受体与G蛋白共存,G蛋白α亚基及β亚基与胰岛素受体可能存在直接的相互作用.     

基于液质联用技术的环二核苷酸cGAMP定量检测方法的建立与评估

目的:建立基于液质联用技术的定量检测环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)的方法体系,用于评价细胞内DNA感受器环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)的活性。方法:在人白血病单核细胞系U937中,以脂质体转染鲱鱼精DNA(HT-DNA)的方式诱导cGAMP合成,采用甲醇-乙腈萃取法提取细胞中的cGAMP分子,真空干燥后利用液相色谱-质谱多反应监测技术(LC-MS/MRM)对cGAMP进行定量检测。同时利用蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR体系对细胞中cGAMP产生后的常规生物学效应指标进行检测,以评价该方法的可靠性。结果与结论:建立的基于液质联用技术检测方法实现了对细胞中cGAMP分子的定量分析。该方法具有特异性好、灵敏度高的特点,为深入研究cGAS的活性调控机制提供了技术支撑。     

酵母双杂合系统

常规研究蛋白质相互作用的生化方法包括化学交联、免疫共沉淀等,这些方法反映的是体外的情况而非体内情况,而且这些方法无法让我们直接克隆与某已知蛋白质作用的未知蛋白质的基因。最近一种新的技术逐渐成熟并得到广泛应用,它就是“Yeast two-hybrid sys-tem”,我们姑且将其译为“酵母双杂合系统”。该技术