核糖醇发酵工艺研究

目的:研究球头三型孢菌Trichosporonoides oedocephalis ATCC 16958发酵生产核糖醇的工艺.方法:采用摇瓶发酵优化的方式,探索培养基组份及三羧酸循环抑制剂对该菌生长及发酵生产核糖醇的影响,并在7L发酵罐中对优化的条件进行发酵验证.结果:对于核糖醇生产,葡萄糖和酵母膏分别是最佳的碳源和氮源,当葡萄糖浓度为20%时,核糖醇产量为38.60g/L.以1%酵母膏为氮源时,核糖醇浓度为37.82g/L.发酵24h添加0.2%的柠檬酸,核糖醇产量提高30.35%.采用摇瓶培养的优化条件,在7L发酵罐中发酵120h核糖醇产量为38.66g/L.结论:实验获得的优化条件可进一步用于指导生产.     

乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

产HSA—CP融合蛋白毕赤酵母的发酵条件优化

为提高重组毕赤酵母生产人血清白蛋白-C肽融合蛋白（HSA—CP）的产量和生产强度,在摇瓶条件下考察了甲醇诱导时间和浓度对目的蛋白产量的影响。结果表明,质量浓度10g/L的甲醇诱导72h最适于产物表达。通过对7L发酵罐中各因素的优化,得到最佳条件为：初始甘油质量浓度10g/L,30℃培养,菌体生长期和诱导期的pH及溶氧分别控制在pH5．0、30％溶解O2或pH6．0、15％的溶解O2。10g/L的甲醇诱导72h,最终使干细胞质量浓度达到56．43g/L,目的蛋白产量达368．45mg／L。生产强度为3．920mg/（L·h）,目标蛋白的比生产速率为5．12mg/（L·h）。     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺

在摇瓶中考察了重组Pichia pastoris发酵的诱导剂量,L-甲硫氨酸,以及pH对腺苷甲硫氨酸产量的影响.放大到3.7 L发酵罐和30 L发酵罐后,研究了重组细胞的发酵过程变化,对S-腺苷甲硫氨酸初步纯化.摇瓶中优化后的发酵条件是:每天添加1%甲醇诱导,L-甲硫氨酸为50mmol/L,培养基pH 5.0.培养144 h后SAM产量达到2.32 g/L.3.7 L发酵罐中发酵251 h后细胞浓度为120 g/L,SAM总量为15.18 g.放大到30 L发酵罐中,发酵225.5 h后细胞浓度约为120 g/L,SAM总量为145.05 g.纯化后SAM的纯度为93.5%,回收率为84.5%.     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度, 在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明, 以下条件：初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度3.1 g甲醇/g DCW、每24 h添加0.51 g甲醇/g DCW、诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0, 最适于菌体生长与产物表达。在此基础上, 7 L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度, 诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat, 发酵结束菌体干重达80 g/L, 酶活为217 U/mL, 比摇瓶结果提高了66.2%。     

葡萄糖酸钙对L-组氨酸发酵的影响及条件优化

目的：提高L-组氨酸的产量并且得出最佳发酵条件。方法：在L-组氨酸的摇瓶发酵实验中,加入20g/L的葡萄糖酸钙,对发酵条件进行优化。结果：L-组氨酸的产量大幅度提高,产酸量由3.00g/L提高到7.50g/L。条件优化后L-组氨酸的产量提高到9.30g/L。结论：发酵培养基中20g/L的葡萄糖酸钙的加入能够诱导葡萄糖酸激酶生成,大幅度提高其比活,增大磷酸戊糖（HMP）途径的通量。有利于L-组氨酸的合成、菌体的生长。     

生物转化合成苯乳酸工程菌的培养条件优化

本研究旨在优化重组大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3) harboring pRSF-aad-ldh10-fdh菌株的培养条件,获得高密的供生物转化苯丙氨酸为苯乳酸的细胞。实验考察了摇瓶发酵培养基碳源、氮源种类和浓度,3 L发酵罐中转速和通气量及恒速补料、DO-stat和pH-stat等不同分批补料策略对菌体密度的影响。结果表明,当碳源为4 g/L葡萄糖,氮源为24 g/L安琪酵母浸粉FM802,细胞干重最大可达9.24 g/L;当转速为400 r/min和通气量为1.5 vvm时,细胞干重最大可达10.18 g/L;以4 g/(L·h)恒速流加葡萄糖时,细胞干重最大可达13.71 g/L。本研究还对工程菌酶表达的诱导条件进行了优化,菌体培养2 h后,添加终浓度为0.08 mmol/L IPTG诱导剂,在25℃下诱导培养14 h所得细胞有利于生物转化。底物苯丙氨酸浓度为60 g/L,转化为苯丙酮酸的转化率为50.2%,转化为苯乳酸的转化率为35.2%。     

高山被孢霉产花生四烯酸发酵条件的研究

通过一株高山被孢霉M_(20)(Mortierella alpina)产花生四烯酸的摇瓶发酵研究,确定了其最佳发酵培养基组成及最适摇瓶发酵工艺条件。摇瓶实验确定的最佳培养基组成为(g/L):玉米粉水解液葡萄糖150,酵母粉15,KH_2PO_4 3.0,NaNO_3 3.0,MgSO_4·7H_2O 0.5。最佳发酵工艺条件为:初始pH6.5,装液量为50ml/500ml摇瓶,摇床转速150r/min,温度在菌体生长前三天控制在25℃培养,以后调至20℃培养。在此条件下,发酵培养被孢霉的生物量、菌体总油脂及花生四烯酸分别高达35.5g/L、13.2g/L及2.2g/L,在15L及1000L自动机械搅拌罐进行发酵试验,AA产量分别高达1.86g/L及1.70g/L。     

L-谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件

以嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)LG-3为出发菌株,经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,磺胺胍(SG)、高浓度(NH4)2SO4定向筛选,获得1株谷氨酰胺高产菌株LG-65,在未经优化的条件下摇瓶发酵72 h可产谷氨酰胺43.5 g/L,比出发菌株的产量32.4 g/L提高了34.3%.在此基础上,对其发酵条件进行优化,经72 h摇瓶发酵产量可达47～48 g/L,7 L发酵罐补料分批发酵40 h可达55 g/L.     

重组角质酶的发酵制备及其对涤纶纤维的表面改性

对大肠杆菌表达嗜热子囊菌Thermobifida fusca角质酶的摇瓶诱导条件及3 L发酵罐扩大培养进行了研究,并探讨了角质酶对涤纶纤维的改性作用。结果表明,在摇瓶培养中,采用工业级TB培养基,用2 g/L乳糖诱导,菌体培养至对数生长前期添加0.5％甘氨酸,角质酶产量可达到128 U/mL。在3 L发酵罐扩大培养中,补料培养生物量 (OD600) 最大达到35,角质酶酶活最高达506 U/mL,是迄今国内外报道细菌来源角质酶的最高水平。紫外分光光度法分析初步表明涤纶纤维经角质酶水解产生了对苯二甲酸类物质     

重组大肠杆菌产尿素酶B高密度发酵条件的优化

探究重组大肠杆菌产尿素酶B（urease B subunit, UreB）的高密度发酵条件。通过实验室摇瓶和30 L发酵罐对UreB基因工程菌的发酵条件进行优化。结果表明：30 L发酵罐中以TB培养基为发酵培养基,接种量为5%,发酵温度为37 ℃,pH为6.8,溶氧量为30%左右,培养至2 h开始恒速流加50%甘油,4 h流加50%酵母提取物和50%胰蛋白胨,并加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG),诱导表达4 h,结束发酵,所得菌体干物质约为25.7 g/L,UreB表达量为31.4%。此工艺可以提高UreB的产量。     

人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化

考察了在大肠杆菌中自诱导表达人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的可行性,并对自诱导培养条件及培养基成分进行优化,以提高蛋白产量。实验结果表明,最优培养基成分为蛋白胨19.17g/L,酵母膏9.59g/L,Na2HPO45.72g/L,KH2PO45.48g/L,(NH4)2SO42.66g/L,NaCl3.33g/L,甘油2%(V/V),葡萄糖0.68g/L,乳糖6.33g/L,MgSO40.24g/L。在温度33°C、接种量1%、pH7、装瓶量20mL/100mL培养条件下,用该最优培养基自诱导表达人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的产量可达348.6mg/L。     

脯氨酰内肽酶培养条件的优化及高密度发酵

基因工程菌E.coliBL21/pGEMPEP可以组成型表达重组的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(PEP),但培养条件极大地影响着酶的产量,为了获得高效表达,首先测定了工程菌表达PEP的稳定性并考察了培养温度、pH、发酵时间、碳源、氮源、无机盐等对产酶的影响,得到了优化的发酵条件,L9(3⁴)正交试验进一步明确了摇床转速、培养温度、pH值、培养时间对产酶量的影响都有高度的统计学意义。在此基础上利用NBSBioFlo3000型5L自控发酵罐进行了高密度、高表达发酵、经20h培养,最终菌体密度达OD₆₀₀60(相当于干菌体225g/L),PEP表达量为28%,每升发酵液中含PEP酶315g。     

重组有机磷水解酶MPH的发酵条件的优化研究

有机磷水解酶在去除有机磷农药残留中具有重要的应用前景。在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了有机磷水解酶(MPH)的重组诱导表达之后,为了实现工业化生产MPH,考察了以乳糖为诱导剂,碳源、氮源、金属离子、培养温度、乳糖浓度及诱导时间等对产酶的影响,得到了优化的发酵条件,L9(34)正交实验进一步确定了最佳的碳源、氮源及乳糖浓度。在此基础上利用7L自控发酵罐进行了发酵过程研究,经12h培养,得到菌体12.65g(DCW)/L,MPH表达量为14.56%,酶活18.69I U/mL。     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

Enhanced expression of cytochrome P450s from lac-based plasmids using lactose as the inducer

The cytochrome P450 expression systems used in Escherichia coli are highly regulated and involve the use of the lac repressor to control expression. Induction in these systems utilizes the nonmetabolizable analog of lactose, isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), which is the most expensive compound required for an E. coli expression system. To determine if the natural inducer lactose could be used to induce cytochrome P450 expression we examined the expression of three P450 enzymes in E. coli using two different expression systems, pTrc99A and the T7-based PET22b vector. For both systems lactose was found to induce expression of active P450 to concentrations that exceeded the levels achieved with IPTG. A 20-liter fermentation of a P450 expression system in the pTrc plasmid in which lactose was used as the inducer resulted in 2.4 micromol P450/liter, with a total yield of 2 g of cytochrome P450. The use of lactose for protein expression in E. coli should be broadly useful for the inexpensive, large-scale production of heterologous proteins in E. coli.     

重组人干扰素βser17工程菌发酵培养条件的优化研究

实验对重组人干扰素βser17(rhIFNβser17)工程菌的发酵培养条件进行了研究,通过实验优化确定了适宜rhIFNβser17表达的培养基、诱导剂使用浓度、诱导时期和诱导后的收获时间等,建立了发酵培养工艺,并在50L发酵罐进行了中试发酵,菌体收获量湿重达13.08g/L,rhIFNβser17表达量占菌体总蛋白的20.2%,纯化后比活性达2×107IU/mg蛋白以上,为进一步的下游开发奠定了基础。