小鼠金属硫蛋白在聚胞藻中的金属诱导表达与纯化

应用蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smt O-P)的金属诱导性,在单细胞的聚胞藻PCC 6803中表达小鼠金属硫蛋白结构基因(mMT-1 cDNA)。在大肠杆菌HB 101中构建含有smt O-P和mMT1 cDNA的穿梭表达载体pKT-MRE,经质粒转移,链霉素筛选,Southern和Western杂交分析鉴定得稳定的转基因工程藻落。同时,做小批量锌诱导表达,并纯化了外源蛋白,5L培养液含鲜藻重5.0g,得到3.5mg mMT-1;转基因藻在高金属浓度下的耐受性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对金属离子的抗性,约为野生藻的2倍。     

水稻寡分蘖突变体的遗传分析和基因定位

从籼粳交组合“圭630/02428”的花培后代中获得一份寡分蘖突变体G069,其主要特征是分蘖速度慢,最高分蘖数少,成熟叶片叶尖、叶缘黄化.用突变体作母本与02428杂交,并以02428作轮回亲本与杂交后代突变型单株回交构建BC₂F₂.对BC₂F₂进行调查和遗传分析,确认突变体G069寡分蘖特性和叶片黄化现象受同一隐性基因控制.以BC₂F₂分离群体为基础,应用SSR标记和RFLP标记进行连锁分析,将寡分蘖基因定位于第2染色体的RFLP标记C424和S13984之间,分别相距2.4和0.6cM.该基因暂定名为ft1.     

H2O2参与棉疫病菌90 kD蛋白激发子诱导的烟草过敏反应和系统获得抗性

野生型烟草Bel-W3叶片经棉疫病菌90kD蛋白激发子处理后,处理叶及其上位叶在24h内均发生2次氧化迸发产生H2O2,且第二次H2O2进发高峰期同时出现,均出现在第12小时,处理部位细胞死亡高峰期比第二次H2O2迸发高峰期滞后8h。引起过敏反应剂量的激发子诱发反义抑制抗坏血酸过氧化物酶anti-APX烟草的过敏性坏死枯斑比野生型的大而且出现得早;不能诱发野生型烟草HR的剂量可以诱导anti-APX烟草发生HR。经激发子处理后anti-APX烟草对烟草疫霉(Phytophtora nicotianae)和TMV产生的诱导抗性比其野生型高。上述结果表明,H2O2可能是一种重要的信号分子,在棉疫病菌90kD蛋白激发子诱发烟草的HR和SAR中具有重要作用,但可能不是一种可以系统移动的信号分子。     

转基因水稻中转录水平cry1Ab 基因的沉默及其阶段复活

以田间环境释放条件下农杆菌介导法转化而成的转cry1Ab 基因水稻为研究对象, 利用GUS组织化学染色法、Western杂交技术, 在不抗虫转基因中8215株系后代中筛选到一个无cry1Ab 蛋白表达产物株系. 分子杂交结果证实, 转基因cry1Ab 在中8215株系后代中发生了转录水平沉默, 整合过程中基因重排使两个拷贝的ubiquitin启动子同时插入到水稻基因组中. 甲基化分析证实ubiquitin启动子区域发生了甲基化, 从而导致cry1Ab基因沉默. 利用去甲基化试剂5-氮胞苷处理转基因沉默水稻种子, 并在苗期、分蘖期、孕穗期、灌浆期及成熟期检测了其对沉默基因的复活效应, 结果表明：5-氮胞苷处理使沉默的cry1Ab 基因在灌浆期恢复表达活性, 复活率约为8%~30%, 且以低浓度(45 mg/L处理1, 2 d)处理的复活率及恢复表达水平较高, 复活基因表达的cry1Ab 蛋白最高可达可溶性总蛋白的0.147%.     

水稻条斑病细菌hrp基因诱导表达系统的建立

水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response)和在寄主水稻上具致病性(pathogenicity)的hrp基因簇是诱导表达的。为研究hrp基因的功能,利用hpa1和hrpX基因的启动子与gfp基因进行融合,构建了hrp基因诱导表达系统。绿色荧光蛋白表达揭示,Xooc的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达。以hrpX和hrpG突变体为参照,RT-PCR研究结果提示,Xooc野生型菌株hpa1基因在NB上不能有效表达,在XOM3培养基上可有效表达。相应地,hrpX突变体中hpa1基因不能被诱导表达,而在hrpG突变体中hpa1基因转录表达水平低于野生菌。研究结果还证实,水稻悬浮细胞能高效诱导Xooc的hrp基因表达。Xooc hrp基因诱导表达系统的建立为研究hrp基因功能、发掘T3SS效应分子以及开展Xooc致病性研究奠定了基础。     

357细菌及其拮抗物质对植物病原真菌的抑制*

Bacilluscereus 357细菌及其分泌的拮抗物质对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌有较好的拮抗作用。它们可抑制或杀死这两种病原菌的菌丝 ,可使菌丝枯萎和产生畸形。 357细菌分泌的拮抗物质还可抑制草莓灰霉病菌孢子的萌发和孢子的形成。该拮抗物质对热、酸、碱等有较高的稳定性。     

几株红假单胞菌属细菌的表观特征及其遗传多样性研究

采用变性梯度胶电泳(DGGE)分析方法和传统的表型特征研究方法、化学方法、核酸杂交方法等技术对14株紫色非硫细菌进行了多相研究。它们均具有红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)的基本特征：具片层状光合内膜结构,出芽分裂,含细菌叶绿素α和正常的螺菌黄素等。根据形态大小、黑暗条件下能否形成好氧菌落及碳源利用上的差异可将14株菌分为T群和gc群两群。用一对引物341f～906r扩增3株标准菌株Rps.palustris ATCC 17001、Rps.rutila R1、Rps.julia ATCC 51105和14株分离株的16S rRNA基因片断,作DGGE分析,结果发现,17株菌中有5个遗传型：gc型、R1型、T型、pal型、jul型。3个标准菌株分别是R1型、pal型、jul型,而14株分离菌株除包括R1型外,另有2个新的遗传型：T型和gc型。几个代表菌株的总DNA的杂交结果表明,T型和gc型可能代表2个新的种群。     

hrpD6基因决定白叶枯病菌在烟草上的过敏反应和在水稻上的致病性

【目的】白叶枯病菌hrp基因簇由包括hrpD6在内的26个hpa-hrp-hrc基因组成,与植物互作后形成Ⅲ型分泌系统(T3S),将T3S效应分子注入寄主细胞中从而决定在非寄主上的过敏反应(HR)和在水稻上的致病性。但hrpD6基因是否参与了白叶枯病菌在非寄主上的过敏反应(HR)和在水稻上的致病性(pathogenicity)还不清楚。【方法】借助同源重组方法,本研究对白叶枯病菌hrpD6基因进行了突变。【结果】PCR和Southern杂交结果显示,hrpD6基因被成功敲除。烟草上测定结果显示,hrpD6突变体ΔPhrpD6丧失了HR激发能力。致病性测定发现,ΔPhrpD6在水稻苗期不能形成水渍症状,在成株期水稻上不具有致病性,并且细菌生长能力显著下降。功能互补结果显示,hrpD6基因可恢复ΔPhrpD6在烟草上激发HR和在水稻上的致病性以及在水稻组织中的生长能力。RT-PCR结果显示,hrpD6基因的转录表达不仅受水稻诱导,而且受hrpG和hrpX基因调控。不仅如此,hrpD6基因突变还影响T3S效应分子hpa1基因的转录表达和Hpa1蛋白的分泌,暗示hrpD6基因对hpa1基因转录表达具有调控作用。【结论】hrpD6基因的缺失导致白叶枯病菌不能激发烟草产生HR和和丧失在水稻上的致病性,主要是HrpD6对hpa1基因转录表达具有调控作用,并影响T3S效应分子Hpa1的分泌。这些结果为进一步分析hrpD6是否参与T3S分泌装置的形成和调控其它hrp基因的转录表达从而决定病菌在非寄主上的HR和在水稻上的致病性,提供了科学线索。     

温度对假单胞菌rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白 (Repressorofsecondarymetabolite ,Rsm)A是一种全局性调控因子 ,与Mrna的RBS结合 ,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术 ,构建了假单胞菌 (Pseudomonas sp .)M-18的rsmA突变菌株M-18R。在 37℃、28℃恒温和短期升温 (37℃、4h培养 ,转 28℃继续培养 )条件下 ,比较野生株M-18和突变株M_18R生物合成藤黄绿菌素 (Plt)和吩嗪-1-羧酸 (PCA)的量。在 37℃条件下 ,M-18和M-18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在28℃条件下 ,M-18R合成Plt的量约为野生型M-18的 10倍 ,达到 270 μg /Ml ,但是合成PCA的量仅为野生型的 50%。经短期升温培养 ,M-18的Plt合成量明显下降 ,PCA产量降低不显著 ;相反 ,M-18R合成Plt的量达到 400μg/Ml ,但PCA产量的变化仍不明显。推测 ,M-18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子 ,在RsmA缺失条件下 ,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成 ,但是 ,并不参与对PCA合成的调控。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T₀代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T₁代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

乌头产吲哚乙酸内生细菌遗传多样性、抗逆性及其对水稻幼苗生长的影响

[目的]探究乌头产吲咮乙酸(IAA)内生细菌的遗传多样性、溶磷解钾能力、抗逆能力及其对水稻幼苗生长的影响,为道地产区乌头产业可持续发展提供科技支撑.[方法]从健康乌头植株分离可培养内生细菌,采用Salkowski比色法测定内生细菌产IAA能力,16S rDNA限制性片段长度多样性(16S rDNA-RFLP)及16S ...     

水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和玉米的侵染

对水稻内生固氮菌N1(短小芽孢杆菌,Bacillus pumilus)、N2(阴沟肠杆菌,Enterobacter cloacae)和N3(鹑鸡肠球菌,Enterococcus gallinarum)的一些生化特性及其对烟草和玉米的侵染进行了研究.采用三亲交配法将标记基因nifH-lacZ、 nifHDK-lacZ和gfp分别导入到固氮菌中,用携带标记基因的固氮菌分别接种烟草云烟85和玉米吉甜6号,对感染固氮菌的烟草和玉米材料进行β-半乳糖苷酶组织化学染色和激光共聚焦扫描显微镜、透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察.光学显微镜和电子显微镜观察结果表明在接菌的烟草和玉米部分根细胞中和细胞间隙都发现了固氮菌,在接菌的玉米茎的维管组织细胞中也发现了固氮菌,推测固氮菌从玉米根开始向上移动.接种固氮菌N3的玉米与对照相比,在鲜重上提高了18.53%.     

恶臭假单胞菌ND6菌株catA基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨

恶臭假单胞菌ND6菌株的萘降解质粒pND6-1中编码儿茶酚1,2-双加氧酶的catA基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并研究表达产物的酶学性质。结果表明:酶的K_m为0.019μmol/L,V_max为1.434μmol/(min.mg);具有很好的耐热性,在50℃保温45min后仍能够保留酶活力的93.7%;Fe²⁺对酶活性有显著的促进作用,其比活力是对照反应的292%;酶对4-氯儿茶酚的催化活性非常低,属于Ⅰ型儿茶酚1,2-双加氧酶。以萘为底物生长时,ND6菌株的细胞提取液中既存在催化邻位裂解途径的儿茶酚1,2-双加氧酶活性,也存在催化间位裂解途径的儿茶酚2,3-双加氧酶活性。以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为唯一碳源生长时,ND6菌株细胞提取液的儿茶酚1,2-双加氧酶活性远远大于儿茶酚2,3-双加氧酶活性。表明ND6菌株既能通过儿茶酚间位裂解途径降解萘,也能通过儿茶酚邻位裂解途径降解萘,而以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为诱导物时只利用儿茶酚邻位裂解途径。