大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶的选择性化学修饰

用九种化学修饰剂研究了大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶分子中的五种不同氨基酸侧链基团与催化活性的关系。结果说明,渡酶活力与硫氧墓完全无关;与色氨酸、精氨酸和组氨酸亦无直接联系;而酪氨酸残基和羧基的修饰引起酶活力急剧下降。其中酪氢酸残基巳被证实是该酶活力的必需基团,处于该酶分子的活性部位。     

R质粒对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶活力的影响

对含有不同R质粒的6株大肠杆菌J53和不含质粒的大肠杆菌J53所产生的L-天门冬酰教酶的活力进行了比较,前者的L-天门冬酰胺酶活力比后者的降低了约1/2—3/4。消除大肠杆菌J53细胞中的R质粒后,L-天门冬酰胺酶活力明显增加并与不含质粒的大肠杆菌J53的相近。结果表明,在大肠杆菌内存在的R质粒对寄主的L-天门冬酰胺酶活力具有明显的抑制作用。     

大肠杆菌(Escherichia coli A S 1.357)L-天门冬酰胺酶的研究I. L-天门冬酰胺酶高产菌株的筛选

从87株细菌中筛选取得L-天门冬酰胺酶的高产菌株大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.357)。采用7.5—10％玉米浆培养基(pH7.0一7.5),于37℃振荡培养8小时,可获得高活力的L一天门冬酰胺酶(4．6单位／毫升)。在我们的实验条件下,葡萄糖不利于L-天门酰胺酶的形成．     

用盐酸胍和Triton X-100从大肠杆菌细胞内释放L-天门冬酰胺酶

研究了用盐酸胍和TritonX 10 0处理ATCCEscherichiacoli 1130 3细胞 ,使细胞内的L-天门冬酰胺酶 (EC 3.5 .1.1)释放到细胞外的方法 ,发现盐酸胍和TritonX 10 0结合使用的效果好。考察了盐酸胍浓度、TritonX 10 0浓度、大肠杆菌细胞浓度、处理时间、pH值等因素对L -天门冬酰胺酶释放的影响。结果表明 ,0 .75～ 1mol/L盐酸胍、2 %TritonX 10 0、细胞浓度 3.2× 10 8/ml、pH 7.0、15℃处理 16～ 2 0h后 ,酶的释放率达到 6 0 %左右。这种方法操作简便 ,酶的释放率较高 ,但对酶无明显的选择性。     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

大肠杆菌青霉素酰化酶的提纯及其性质的研究

大肠杆菌(Escherichia coli) AS 1.70发酵液经有机溶剂处理,硫酸铵分级,再用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到了聚丙烯酰胺凝肢电泳均一的青霉素酰化酶纯品。纯酶作用的最适温度为45—55℃,最适pH为7．0—7．7,在无NIPAB存在下,纯酶在45℃以下稳定,但在55℃保温一小时,酶活力残存33．58％,纯酶在pH5．0—8.0稳定。酶作用于重排酸的米氏常数为3．33×10-2g／ml。Ag+对酶有抑制作用。用聚丙烯酰胺薄层凝胶等电聚焦测定酶的等电点(pI)为6．7—6．8,用SDS凝胶电泳测酶的亚基分子量分别为14300和58900。纯酶具有水解苯甘氨酸甲酯盐酸盐的作用,反应两小时产生12．74mM苯甘氨酸。     

用双水相系统从大肠杆菌细胞内释放L-天门冬酰胺酶

聚乙二醇－磷酸盐双水相系统可以释放大肠杆菌ＡＴＣＣ１１３０３细胞内的Ｌ－天门冬酰胺酶。研究了聚乙二醇、磷酸氢二钾的浓度对酶和蛋白质的释放及分配的影响。在双水相系统中加入适量的盐酸胍和ＴｒｉｔｏｎＸ１００可以提高酶的释放量。实验表明,用新的下相代替富含酶的下相,上相能够重复使用几次。这种方法将酶的释放和萃取结合为一个步骤,使酶的纯化更加简单和有效     

高产天冬氨酸酶的大肠杆菌细胞的固定化

用聚乙烯醇凝胶包埋具有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌(Escherichia coli)No.1细胞。该酶的表现活力高达1638 00u／g湿细胞,酶活力的回收率为97．5％。固定化细胞和游离细胞天冬氨酸酶的最适pH均为8．0,最适温度分别为40—45℃和40—55℃。二价金属离子Mn2+、Mg2+、Ca2+和Fe2+对热钝化的天冬氨酸酶活力具有保护作用。在37—45℃下,两种细胞的热稳定性相同。二者在pH6．0的柠檬酸缓冲液中比较稳定。固定化细胞在1mol／L、pH8．0的底物溶液(内含Mn2+1mmol／L)中于4℃冰箱保存6个月,天冬氨酸酶的活力保持不变。用固定化细胞柱连续生产L-天冬氨酸,底物转化为产物的转化率达95％以上;产物的总 收率为91．1％。固定化细胞柱连续运转40天,天冬氨酸酶活力仍保持最初酶活力的90％。     

黑曲霉M89菊粉酶的提纯与性质

黑曲霉(Aspergillusniger）M89菊粉酶经硫酸铵分级盐析、SephadexG-200凝胶过滤、DEAE-纤维素离子交换层析、聚丙烯酞胺凝胶电泳（PAGE）制备分离,提纯到4个菊粉酶组分EⅠ、EⅡ、EⅢ和EⅣ。用SDS-PAGE测定分子量分别为102．6、97．9、61．2和36．5kD;用等电聚焦电泳测得其等电点分别为4．15、4．24、4．48和4．15。4个组分的最适反应温度均为55～60℃;EⅠ的最适pH为pH4．0,其余3个组分为pH4．5．各组分的热稳定性有一定差异,分子量越小的组分,热稳定性越好,55℃处理90min,EⅠ有一定的热失活,其余3个组分无活力丧失,4个组分都是外切酶。     

嗜热链霉菌过氧化氢酶的纯化及性质研究

嗜热链霉菌(Thermostreptostreptomyces sp.)T485的除去菌体的培养液,经硫酸铵盐析,Sepha- dex G—100、DEAE—Sephadex A-50及羟基磷灰石等柱层析,得到了凝胶电泳均-的过氧化氧酶,纯化了954倍,得率为7％。用浓度梯度PAGE测定分子量为152000,SDS—PAGE测定亚基分子量为57000,凝胶薄层等电点聚焦测定等电点为4．25。过氧化氢酶的反应最适温度为60℃,最适pH为7．0;对H2O2的K为50 mmol·L-1,Vmas值为6．0 mmol·min-1·mg-1。Nall3和Hg2+对酶活力有强烈抑制作用．Ca2+对酶活力有激活作用。测定了波长200—500nm的吸收光谱,在405nm处有明显的吸收峰。根据受NaN3,抑制和吸收光谱性质,推测它为含血红素酶。此外还测定了过氧化氢酶的氨基酸组成。     

康氏木霉C1酶的简捷提纯法及酶性质的研究

康氏木霉(Trichoderma Koningii)白色变异菌株AS 3．4001的粗酶制剂,经Sephadcx G-75凝胶过滤柱脱盐并除去大量杂蛋白,然后通过DEAE—scphadcx A一50离子交换层析,用0—0.5M Nacl梯度冼脱即得c。酶纯品。全程序仅需二天时间。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳及SDS电泳鉴定均为单一带。此酶的分子量用SDS电泳及凝胶过滤法测定分别为58,000和5 2,000,用等电聚焦测其等电点为pH4 0。作用最适pH也为q o。此酶有较好的稳定性,在酸性pH(2 2)、碱性pH(8 0)及中性(水)中均能保持较长时间而不丧失活力。     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

通过聚乙二醇6000一磷酸钾缓冲液双相分离,Sephadex G—100凝胶过滤、DEAE-Sephadcx A-50及SE-Se phadex C-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspe rgillutphoenlcis)麦麸培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH5．0,最适温度60℃,在pH 4．0--7．5之间及55℃以下稳定。Ag+及Hg2+对该酶有强烈的抑制作用。用SDS-凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶均分子量分别为118000及195000薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH 3.95。     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅱ.比较家蚕和野蚕谷氨酰胺酶及天门冬酰胺酶,蓖麻蚕丝腺体中天门冬酰胺酶之提取及其性质之研究

(1)比較家蚕(华九-云瀚)和野蚕(萞麻蚕、柞蚕和樗蚕)之谷氨酰胺酶及天門冬酰胺酶之活力,发現在萞麻蚕絲腺体后部之細胞顆粒部分中,存在有活力甚強之天門冬酰胺酶。(2)自萞麻蚕絲腺体后部提取之天門冬酰胺酶制品中,不含有谷丙轉氨酶、谷天轉氨酶及谷氨酰胺酶。(3)L-天門冬酰胺之酶促水解作用在1小时过程中,活力和作用时間基本土表現直线关系。(4)萞麻蚕絲腺体后部之天門冬酰胺酶和哺乳类动物、植物及微生物之pH影响相同;在pH5以下不稳定,最适pH为8。(5)天門冬酰胺酶对热不稳定,先以不同温度和酶溶液作用10分钟,60℃时,活力丧失80%左右。(6)对氯汞苯甲酸(10~(-4)M)抑制天門冬酰胺酶20%,溴化乙酰胺(10~(-3)M)及DL-环絲氨酸(10~(-3)M)抑制15%。     

产气气杆菌茁霉多糖酶的研究I．酶的提纯和性质

产气气杆菌(Aerobacter aerogenes) 10016的茁霉多糖酶(pullulanase E．C．3．2．1．41)用Sephadex G100凝胶过滤、聚丙烯酰胺垂直板型凝胶电泳进行纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的纯酶。纯酶作用的最适温度为50℃,最适pH为5．3—5．8,耐热性较差,50℃ 4小时后仅存活力10％。纯酶在pH4．3一8．6稳定。酶作用于糯米淀粉的米氏常数Km为2.0×10-2克／毫升。用聚丙烯酰胺薄屡凝胶等电聚焦测定酶的等电点pI为3．8,用SDS凝胶电泳测定酶的分子量为51,000—52,000;此酶是一种糖蛋白;含糖总量为6．5—7．0％;纯酶能专一性的水解茁霉多糖、糯米淀粉,也能分解糊精,而不作用于糖原、纤维二糖以及环状糊精。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的研究——Ⅱ.透明质酸酶的纯化和性质

用CM-Sephadex C-50,Sephadex G-75以及CM-Sephadex C-25柱层析,从尖吻蝮蛇毒中分离提纯透明质酸酶,得到一个电泳均一的纯品,活力提高45倍。纯品不具有出血活性。用凝胶过滤方法测得分子量为33,000±330,等电点约10.3,PAS染色证实是糖蛋白。纯化的透明质酸酶的最适pH为3.5～5.0,最适温度是37℃,在中性和碱性环境中迅速失活,不耐热。Fe~( )、Cu~( )、肝素对酶活力有明显的抑制作用。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的研究——Ⅱ.透明质酸酶的纯化和性质

用CM-Sephadex C-50,Sephadex G-75以及CM-Sephadex C-25柱层析,从尖吻蝮蛇毒中分离提纯透明质酸酶,得到一个电泳均一的纯品,活力提高45倍。纯品不具有出血活性。用凝胶过滤方法测得分子量为33,000±330,等电点约10.3,PAS染色证实是糖蛋白。纯化的透明质酸酶的最适pH为3.5～5.0,最适温度是37℃,在中性和碱性环境中迅速失活,不耐热。Fe~( )、Cu~( )、肝素对酶活力有明显的抑制作用。     

荔枝果皮过氧化物酶的纯化及部分酶学性质研究

经硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose和Sephadex G-75柱层析分离,从荔枝果皮中分离提纯了过氧化物酶(POD),该酶被纯化了12．5倍,产率为1．9％。经SDS-PAGE确定为单一条带。该酶最适反应温度为35℃,对热具有较强的稳定性,经75℃处理30min,酶活性只损失50％。最适pH约为6．5,但在pH4．0—8．0范围内活力仍比较稳定。该酶在25℃和0．05mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)条件下对愈创木酚、邻苯二酚和没食子酸的Km分别是2．75、12．4和12．8mmol／L。二硫苏糖醇和抗坏血酸能完全抑制POD活性,L-半胱氨酸、柠檬酸、FeS04、GSH、SDS和ZnS04对POD活性有一定的抑制作用,而FeCl,和CuSOt对POD则有较好的激活作用。     

脂肪酶产生菌Geofrichum sp. AS 2.1135产酶条件及酶一般性质的研究

在92株能同化油的地霉属菌株中,Geotrichum sp. AS2．1135菌株产脂肪酶活力为50—60u／ml,对其产酶条件的研究表明,不饱和长链脂肪酸和油类有利于酶的形成。在4％豆饼粉作为有机氮源的培养基中,加入0．2％尿素,酶活力显著增加,酶活达150u／ml。用聚乙二醇橄榄油乳化系统测定酶的作用最适pH为8．0,最适温度为4O一42℃。在pH4一9时5℃下存放24小时,或在pH 5和8时45℃保持15分钟,酶活力不变。     

饲用型青霉α-半乳糖苷酶活力测定的研究

研究了比色法测定饲用α-半乳糖苷酶活力,以对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷为底物和对硝基苯酚作标准产物。酶活力的测定条件受很多因素的影响,如酶浸提液的pH、酶液稀释倍数、反应温度、作用时间。其中稀释倍数和pH的影响较为显著。稀释酶液的酶活测定值在0．02～0．07U／mL内较为合适。考虑到动物饲用酶制剂的特殊性,测定α-半乳糖苷酶活力时建议规定pH为5．5,反应温度为40℃。根据研究结果,反应时间采用10min,比色波长405nm为宜。     

微生物转谷氨酰胺酶的纯化方法和酶学性质研究

由Streptoverticillium mobaTaense发酵生产的转谷氨酰胺酶经过除茵体、超滤浓缩、乙醇沉淀、干燥后得到粗酶产品,其活力回收率约70％。又经Superdex-75凝胶过滤和Source 30S阳离子交换两步纯化后得到纯酶,最终酶活力收率约37％。酶最适温度为50℃,在40℃以下稳定性良好;最适pH为6．0,pH4．0～8．0时比较稳定。离子强度对酶影响很小。