嗜水气单胞菌致病性研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)是我国养殖鱼类的重要病原,对其侵袭机制和毒力因子的研究有重要的意义。本文对嗜水气单胞菌的生物学特性、致病机制、毒力因子及其防治措施进行了综述。     

琼脂扩散溶血试验测定嗜水气单胞菌HEC毒素的溶血价

建立琼脂扩散溶血试验用以测定嗜水气单胞菌HEC毒素的溶血价,同时与分光光度法及微量溶试验进行比较,结果表明琼脂扩散溶血试验所测溶血价滴度要高于前两种方法,而且重复性好,结果易于判定。     

副溶血弧菌的致病机制

副溶血性弧菌是引发微生物食源性疾病的首要病原菌,其在临床上主要引起3种疾病,即胃肠炎、伤口感染和败血症。经过多年的研究,人们对副溶血性弧菌的致病机制有了一定的认识。我们着重介绍副溶血性弧菌的主要毒力因子、毒力基因表达调控及常用的毒力表型研究方法。     

水产品中嗜水气单胞菌耐药性研究进展

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila具有广泛的致病性,是水生动物最常见的致病菌之一。由于抗生素不合理使用、质粒以及耐药基因的水平转移等因素,来自零售市场、超市和餐厅的即食海鲜产品中,均可分离出大量的嗜水气单胞菌耐药菌株及其耐药基因。因此,探明关键控制点、寻求有效缓解抗生素耐药性的防控策略至关重要。文中介绍了我国嗜水气单胞菌的耐药现状,嗜水气单胞菌的主要侵染及耐药机制,以及目前削减和防控耐药性的主要手段和策略,并对水产品耐药性研究方向和重点作出展望。     

霍乱弧菌和副溶血弧菌分离株的gyrB基因系统发育分析

依据gyrB基因部分编码序列构建系统发育树以分类和鉴别霍乱弧菌和副溶血弧菌,并探讨其种系发生关系。扩增并测序13株霍乱弧菌、8株副溶血弧菌、2株嗜水气单胞菌及1株类志贺邻单胞菌的gyrB基因(编码DNA促旋酶B亚单位)序列,并采用距离法与最大似然法构建系统发育树。两种方法所构建的树结构完全一致,霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌及类志贺邻单胞菌各自形成一个独立的簇。其中,霍乱肠毒素基因(ctxA)阳性的霍乱弧菌(8株O139群与2株O1群ElTor型)聚类成一分枝;3株副溶血弧菌临床株(1株2002年流行株,2株2004年分离株)与1日本菌株及2001年1株自环境分离的毒力株聚类。系统发育分析靶分子gyrB基因可以良好区分上述4种常见病原菌。产毒O139群霍乱弧菌与产毒O1群ElTor型霍乱弧菌关系密切。副溶血弧菌环境毒力株与本地区临床主要流行株在系统发育关系上较为接近,可能是潜在的致病菌。     

嗜水气单胞菌和河弧菌二联疫苗对鲫的免疫效果

在采用正交试验设计优化了Aeromonas hydrophila和Vibrio fluvialis二联全菌疫苗制备工艺的基础上,研究了采用该工艺制备的疫苗对鲫的免疫保护效果。结果表明注射免疫鲫4周后,抗A.hydrophila和V.fluvialis血清凝集效价分别为：1:4--1:32和1:2--1:16,平均都为1:10,但对攻毒均具有有效的保护作用。浸泡免疫、高渗浸泡免疫或加多糖浸泡免疫在免疫4周后,对A.hydrophila攻毒均无保护作用;然而,加多糖浸泡免疫对V.fluvialis攻毒可产生有效的保护。免疫扩散试验表明,在煮沸并经超声波处理后的A.hydrophila的A.hydrophila或V.fluvialis菌液中均存在两种优势抗原。     

嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制

【目的】调查从浙、苏、皖等地水产动物中分离的23株致病性嗜水气单胞菌的耐药谱并探索喹诺酮类抗生素耐药菌株的耐药分子机制。【方法】根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011版)测定23株嗜水气单胞菌耐药谱并筛选喹诺酮类抗生素耐药株;对筛选的耐药菌株和体外诱导耐药菌株的gyrA和parC基因耐药决定区进行分析;用二倍稀释法测定加入多重耐药外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙前后耐药菌株对恩诺沙星最小抑菌浓度的变化,同时检测喹诺酮类药物相关的外排泵基因qepA、oqxA和mdfA;并检测质粒介导的喹诺酮耐药的qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS。【结果】所有菌株都存在对5种以上药物的耐药性;39.1%(9/23)的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中55.6%(5/9)对恩诺沙星耐药。耐恩诺沙星的5株菌株均携带qnrS,而不携带qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,也不携带外排泵基因qepA、oqxA和mdfA。其中耐药菌株AH19同时存在gyrA与parC基因双突变、质粒介导的耐药基因qnrS和主动外排泵三种耐药机制,菌株AH4、AH7和AH20存在gyrA与parC基因双突变和质粒介导的耐药基因qnrS两种耐药机制,AH6存在gyrA基因突变和质粒介导的耐药基因qnrS机制,体外诱导耐药菌株ATCC7966-QR相对于原始菌株ATCC7966发生了gyrA与parC基因双突变。【结论】喹诺酮类药物作用靶位的改变和质粒介导的耐药基因qnrS的存在是本研究中涉及的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的主要作用机制,主动外排泵机制是个别菌株存在的耐药机制。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制

摘要:【目的】调查从浙、苏、皖等地水产动物中分离的23 株致病性嗜水气单胞菌的耐药谱并探索喹诺酮类抗生素耐药菌株的耐药分子机制。【方法】根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011 版)测定23株嗜水气单胞菌耐药谱并筛选喹诺酮类抗生素耐药株;对筛选的耐药菌株和体外诱导耐药菌株的gyrA和parC基因耐药决定区进行分析;用二倍稀释法测定加入多重耐药外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙前后耐药菌株对恩诺沙星最小抑菌浓度的变化,同时检测喹诺酮类药物相关的外排泵基因qepA、oqxA和mdfA;并检测质粒介导的喹诺酮耐药的qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS。【结果】所有菌株都存在对5种以上药物的耐药性;39.1%(9/23)的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中55.6%(5/9)对恩诺沙星耐药。耐恩诺沙星的5株菌株均携带qnrS,而不携带qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,也不携带外排泵基因qepA、oqxA和mdfA。其中耐药菌株AH19同时存在gyrA与parC基因双突变、质粒介导的耐药基因qnrS和主动外排泵三种耐药机制,菌株AH4、AH7和AH20存在gyrA与parC基因双突变和质粒介导的耐药基因qnrS两种耐药机制,AH6存在gyrA基因突变和质粒介导的耐药基因qnrS机制,体外诱导耐药菌株ATCC7966-QR相对于原始菌株ATCC7966发生了gyrA与parC基因双突变。【结论】喹诺酮类药物作用靶位的改变和质粒介导的耐药基因qnrS的存在是本研究中涉及的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的主要作用机制,主动外排泵机制是个别菌株存在的耐药机制。     

副溶血弧菌的毒力基因表达调控的分子机制

副溶血弧菌是革兰氏阴性嗜盐细菌,是海洋脊椎动物和无脊椎动物中主要致病菌,也是引起人类急性肠胃炎、败血症和坏死性筋膜炎等疾病的主要病原体。在过去,由副溶血弧菌引起的致病感染在世界范围内有不断增加的趋势。副溶血弧菌的致病性与其自身产生的多种毒力因子有关,这些毒力因子包括粘附因子、脂多糖、溶血素、III型分泌系统、VI型分泌系统、铁摄取系统、蛋白酶、外膜蛋白等。然而,这些毒力因子的表达都受到环境因子以及宿主体内信号因子的调控。副溶血弧菌通过感知外界生存环境的各种信号因子,从而激活体内不同的信号通路,进而诱导不同的毒力因子的表达。本文主要对副溶血弧菌毒力因子表达调控的分子机制进行综述,为更好地理解宿主与病原体的相互作用对副溶血弧菌的致病机制的影响,以及为今后预防和治疗由副溶血弧菌所引起的疾病提供理论参考。     

副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程研究

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过荧光原位杂交(FISH)观察混合生物被膜形成。【结果】虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御不适应环境中起重要作用,通过FISH可观察到不同时期生物被膜的变化过程。【结论】VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。研究混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。     

乌梅提取物对溶藻弧菌的抑制效应与机理

[背景] 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）能够感染鱼、虾、贝等海洋经济动物,给海水养殖业带来了严重的经济损失,对公众健康及食品安全也构成较大威胁。[目的] 通过研究乌梅（Fructus mume）对溶藻弧菌的抑菌效应及其机理,为乌梅在水产养殖中的进一步开发利用提供理论依据。[方法] 采用试管二倍稀释法测定乌梅提取物（Fructus mume Extract,FME）对溶藻弧菌的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration,MIC）和最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration,MBC）,电导率仪检测溶藻弧菌的相对电导率,分光光度法分析溶藻弧菌的核酸泄露和呼吸链脱氢酶活性及生物膜抑制率,蛋白质电泳检测溶藻弧菌的蛋白质合成情况,扫描电子显微镜观察溶藻弧菌的亚显微结构。[结果] 乌梅提取物对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为1.953 mg/mL和3.906 mg/mL;乌梅提取物显著增加了溶藻弧菌的相对电导率和核酸泄露,明显降低了溶藻弧菌蛋白质的合成能力,对于弧菌的亚显微形态产生了较大影响。同时乌梅提取物显著抑制了溶藻弧菌生物膜的形成和呼吸链脱氢酶的活性。[结论] 乌梅提取物通过增加溶藻弧菌细胞膜通透性及显著抑制生物膜的生成、呼吸链脱氢酶活性及蛋白质的合成,实现抑制及杀灭溶藻弧菌的目的。     

副溶血性弧菌生物被膜形成及其调控机制研究进展

副溶血性弧菌是一种广泛存在于海产品中并可引起人类急性肠胃炎的食源性致病菌。该菌形成的生物被膜能够增强体外环境中的存活率,促进对宿主的定殖和感染,还会导致被污染的加工设备与食物之间发生交叉感染。深入了解生物被膜形成背后的调控机制,有助于制定有针对性的策略,干扰其适应环境变化的过程,从而降低副溶血性弧菌对人类的危害。本文主要综述了鞭毛、菌毛和胞外的多糖等基质组分在生物被膜形成中的作用以及c-di-GMP和群体感应对生物被膜形成的调控。     

副溶血性弧菌CRISPR的检测及其结构分析

【目的】检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,简称VP)中规律成簇间隔的短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),并对不同来源的VP中CRISPR位点的结构多样性进行分析。【方法】根据CRISPR DB数据库中公布的VP中确定的CRISPR结构序列CRISPR-1及文献中新发现的疑似CRISPR结构序列CRISPR-2设计引物,对不同来源的79株VP进行PCR扩增。利用CRISPR Finder分析CRISPR结构,采用生物信息学方法对不同来源VP的CRISPR位点结构多样性进行比较分析。【结果】79株VP中CRISPR-1的检出率为92.41%,CRISPR-2的检出率为96.20%,同时具有这2个位点的菌株占总数的89.87%,只有1株菌被检出不含有任何位点。分别比较不同来源的菌株CRISPR-1、CRISPR-2位点的重复序列发现不存在序列差异,而临床菌株的这2个CRISPR位点在间隔序列上比环境分离菌株存在更多的变异。2个CRISPR位点根据间隔序列的不同在VP中一共组成8种CRISPR谱型(编号A-H),除F谱型外,A-E、G谱型均只在临床分离菌株中发现,而在环境分离菌中还发现不含任何位点的H型。【结论】CRISPR在VP中普遍存在。环境分离菌株与临床分离菌株中CRISPR的结构存在差异。     

抗生素对溶藻弧菌SXT/R391元件转移频率的影响北大核心CSCD

【目的】研究萘啶酸、诺氟沙星、卡那霉素3种抗生素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SXT/R391元件ICEVal A056-1转移频率的影响。【方法】利用PCR检测溶藻弧菌A056中ICEVal A056-1的自我剪切、转移潜力。通过溶藻弧菌A056与大肠杆菌菌株VB111的接合实验,研究溶藻弧菌分别在含不同浓度萘啶酸、诺氟沙星、卡那霉素的LB培养基中培养15 min或30 min后,ICEVal A056-1转移频率的变化规律。【结果】溶藻弧菌A056细胞中有环状形式的ICEVal A056-1分子存在,具有水平转移潜力;溶藻弧菌A056在含40μg/m L萘啶酸的LB中培养30 min后,ICEVal A056-1转移频率是对照组的19.59倍;在含50μg/m L诺氟沙星的LB中培养15 min后,ICEVal A056-1转移频率是对照组的31.25倍;在含不同浓度卡那霉素的LB中培养30 min后,ICEVal A056-1转移频率与对照组没有显著差别。【结论】部分抗生素的使用可以明显促进溶藻弧菌ICEVal A056-1向大肠杆菌的转移,因此海洋环境中抗生素的滥用及随意排放很可能加剧ICEs(integrating conjugative elements)从溶藻弧菌到其他细菌的传播。     

H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控

【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。     

ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100lpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化His-ToxR蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100lpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上,而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述,ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成,从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。     

水产动物副溶血性弧菌的拮抗菌研究进展

细菌性疾病的爆发常造成水产养殖业的巨大经济损失,其中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的细菌性疾病更是引起了人们的关注.拮抗菌在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接对病原菌产生抑制或竞争作用来抑制或杀死病原菌,在病害防治中发挥着重大作用.对副溶血性弧菌拮抗菌的种类、产生拮抗物质的种类、筛选拮抗...