生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的耐药特征、毒力基因及agr分型

为研究市售生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染状况,分两个季节从雅安市雨城区采集351份生鲜猪肉样本,采用K-B法检测分离株的耐药性,PCR技术对分离株的mecA基因、传统肠毒素基因、中毒休克综合征毒素基因、杀白细胞毒素基因、溶血素基因和脱皮毒素基因进行分析和agr分型。结果表明,夏、冬季总体检出率分别为15.28%和28.69%;分离株对青霉素、四环素、红霉素的耐受性最强;5种传统肠毒素的检出率为80%,sea、sed的检出率均为4.11%,seb、sec的检出率均为12.33%;中毒休克综合征毒素基因的检出率为15.07%,溶血毒素基因检出率最高,杀白细胞毒素基因和脱皮毒素基因检出率最低。分离株以agrⅠ型为主（50.68%）,未检测出agrⅣ 。综上表明,该地区生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染较为严重,分离株呈多重耐药谱,毒力基因分布多样,部分菌株致病性较强,具有的潜在危险应引起重视。     

金黄色葡萄球菌tst-1基因敲除菌株的构建

抽提金黄色葡萄球菌834菌株的基因组DNA,PCR克隆扩增tst-1及tst-1的上、下游基因,通过将tst-1上、下游基因分别重组到载体质粒pAULA中,形成同源重组质粒pAULA Δtst-1,将pAULA-Δtst-1电转入细菌内,进行同源重组,以PCR、Western blot鉴定tst-1基因敲除菌株无tst-1基因片段,且无TSST-1蛋白表达,表明已成功构建金黄色葡萄球菌tst-1基因的敲除菌株。     

基于CRISPR/Cas13a的金黄色葡萄球菌mecA耐药基因检测方法的建立

【目的】 针对目前耐药基因检测通常需要依赖专业检测设施和设备,仍缺乏耐药基因快速检测方法这一问题,旨在建立一种基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) mecA耐药基因快速检测方法。【方法】 首先在mecA基因序列的保守区中设计筛选出灵敏度较高的重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)引物和CRISPR RNA (CRISPR RNA, crRNA),通过结合消线法核酸检测试纸技术(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)建立针对mecA基因的检测方法,最后利用模拟样本及临床分离样本对建立的新方法与传统方法进行比较。【结果】 成功筛选出了1组针对mecA耐药基因的高效扩增引物和crRNA,并建立了基于CRISPR-ERASE的mecA耐药基因高灵敏核酸检测方法,最低检出限为10 copies/μL,在32株临床分离的金黄色葡萄球菌中,该方法共检出24株mecA耐药基因阳性菌株,与药敏试验及荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)检测结果符合率为100%。【结论】 建立了一种基于CRISPR-ERASE核酸检测试纸技术的简单、高灵敏的mecA耐药基因检测方法。     

金黄色葡萄球菌的快速检测方法

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒常见的病原菌之一,其传统检测方法(选择性培养、生化鉴定)步骤多,操作复杂,耗时长、灵敏性不高。近年来以抗原抗体反应为基础的免疫学方法和以DNA为基础的分子生物学技术以其快速性、准确性已经成为微生物检测方法的发展方向。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了对肉中金黄色葡萄球菌检测的方法。实验中,使用了最新的Bst 20 WarmStart DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,并针对金黄色葡萄球菌所特有的保守性耐热核酸酶基因（nuc）设计得到了一套LAMP扩增引物。对LAMP法和PCR法的检测灵敏度进行了比较,同时对人工污染肉中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明：所建立的LAMP法能够特异性的检测金黄色葡萄球菌,并且检测金黄色葡萄球菌纯菌的灵敏度为201×100CFU/mL,是普通PCR检测灵敏度的100倍。在检测肉中金黄色葡萄球菌时,检测限为201×101CFU/mL。因此,本实验所建立的LAMP法检测肉中金黄色葡萄球菌的方法,具有灵敏、快速以及简便等的优点,是一种具有很好的发展前景的检测手段。     

金黄色葡萄球菌中PVL基因与噬菌体DNA的同源性*

为了探讨金黄色葡萄球菌PVL基因与噬菌体的相关性 ,从 4株含有PVL基因的菌株中分离出DNA ,用HindⅢ或EcoRⅠ酶切后 ,分别与PVL和LukM-lukF-PV探针进行Southern印迹杂交 ,以及对含有PVL基因及其下游区域的片段克隆、测序和同源性分析。结果表明3株菌的PVL基因及其下游区域的序列与V8菌株噬菌体∮PVL的PVL基因及其下游噬菌体attsite的序列     

食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测方法

采用反向被动乳胶凝集法 (RPLA)和mini VIDAS (ELFA)两种方法对 42份金黄色葡萄球菌阳性样品进行了肠毒素检测。结果RPLA法的金葡菌肠毒素检出率为 61.9% (P<0.05 )要高于ELFA法的检出率 50.0% (P <0.05 ) ,但检测时间长 ( 20h)。在实验中我们还发现 ,血浆凝固酶阴性的葡萄球菌也可产生肠毒素 ,其原因有待进一步的研究。     

快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立与应用

目的建立一种快速准确定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。方法以femB、SEA基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A的靶序列,设计合成引物和TaqM an探针;收集腹泻患者大便标本分离的金黄色葡萄球菌68株,并定量检测其肠毒素A。结果TaqM an探针荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球和肠毒素A的灵敏度均为1.0×102拷贝。68株金黄色葡萄球菌中检出产肠毒素A菌株11例(16.2%,11/68),CT值为13.5~20.6。结论TaqM an探针荧光聚合酶链反应能够准确快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A。     

实验动物金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

目的建立一种能够应用于实验动物金黄色葡萄球菌检测及鉴定的环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）方法。方法本研究针对金黄色葡萄球菌特异的nuc基因设计4条引物,对反应条件进行优化。结果通过优化,该方法 60℃、40 min、Mg2＋浓度8 mmol/L、dNTP浓度2.0 mmol/L、甜菜碱浓度0.8mmol/L时,对金黄色葡萄球菌检测限为2 cfu,且与其它常见实验动物致病菌无交叉反应。反应结果可通过添加荧光染料SYBR green I直接肉眼观察。结论本研究建立的金黄色葡萄球菌LAMP方法具有快速、灵敏、操作简单、设备要求低的特点,适用于基层、大批量样本、快速检测的要求。     

基于Cre/loxP系统的睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠模型的构建及敲除效率检测

极长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLC-PUFAs)是哺乳动物视网膜、睾丸等极少数组织中特有的脂肪酸,其生物合成的关键酶为极长链脂肪酸延长酶4(very long chain fatty acid elongase 4,Elovl4)。建立组织特异性敲除Elovl4基因的动物模型有利于深入研究VLC-PUFAs的生物学功能,因此,本研究基于Cre/loxP系统,先分别构建了Stra8-Cre小鼠和Elovl4 floxed小鼠,通过杂交获得(Elovl4[flox/+],Stra8-Cre)杂合子基因敲除小鼠,再选择雌鼠与Elovl4 floxed纯合子雄鼠即Elovl4 [flox/flox]雄鼠杂交,通过基因型鉴定筛选获得(Elovl4[flox/flox], Stra8-Cre)纯合子小鼠。利用RT-PCR、qRT-PCR、Western blotting、免疫组化和免疫荧光检测Elovl4在睾丸组织中的敲除效率,结果表明,无论是杂合子还是纯合子基因敲除小鼠,其睾丸组织中Elovl4的表达在mRNA及蛋白水平显著下调,但其他组织未受影响。本研究成功构建了睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠,为后续研究VLC-PUFAs对雄性小鼠生殖功能的影响及相关分子机制提供可靠的动物模型。     

金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的免疫治疗策略

金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins,SEs）是由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的一类具有呕吐活性的细菌外毒素，可引起严重的炎症反应和食物中毒。SEs具有超抗原活性，可与T细胞受体的可变区和MHC II类分子形成三元复合物（TCR-SEs-MHC II），直接刺激T淋巴细胞大量产生肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素（interleukin,IL）-2、IL-6和γ干扰素（interferon γ,IFN-γ）等细胞因子，从而导致中毒性休克综合征（toxicshocksyndrome, TSS）。在临床常见的SEs中，肠毒素A (staphylococcalenterotoxin A, SEA)和肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)是出现频率最高、毒性最大、危害最严重的两种。目前尚没有针对SEs中毒治疗策略的综述性研究。本文首先概述了SEs的分类、结构及毒性作用，重点围绕SEA和SEB，分析了TCR-SEs-MHC II类...     

馒头中金黄色葡萄球菌生长预测模型的建立

以传统面制品馒头作为研究对象,采用修正的Gompertz（SGompertz）和修正的Logistic（SLogistic）作为一级生长模型,应用Origin 9.0软件分别拟合馒头中金黄色葡萄球菌在10、15、25、30和37 ℃的生长情况,获得其最大比生长速率（μ_max）和迟滞期(λ)。采用平方根模型和二次多项式模型建立馒头中金黄色葡萄球菌的二级生长模型,并对该模型进行验证。结果表明,SGompertz模型能较好地拟合馒头中金黄色葡萄球菌的生长。以μ_max建立的平方根和二次多项式模型,R²分别为0.931 5和0.932 0,偏差因子（B_f）分别为1.123 2和1.050 1,准确因子（A_f）分别为1.221 0和1.190 2,表明采用μ_max进行拟合时,二次多项式模型的拟合效果较好;以迟滞期λ建立的平方根和二次多项式模型,R²分别为0.948 4和0.969 6,B_f分别为0.890 1和0.912 2,A_f分别为1.541 1和1.180 3,表明采用迟滞期λ进行拟合时,二次多项式模型的拟合效果较好。本研究可为馒头等传统面制品的定量风险评估提供参考。     

抗金黄色葡萄球菌感染的新药研究进展

金黄色葡萄球菌因抗菌药耐药性而引起广泛关注,其耐药株感染所引起的皮肤和软组织感染、肺炎、菌血症以及骨髓炎等增加了患者的发病率和死亡率。金黄色葡萄球菌通常通过携带多种耐药基因、毒力基因或形成生物被膜等方式快速适应生存环境而产生耐药性,使得常规抗菌药物难以达到理想的治疗效果,因此,金黄色葡萄球菌感染的治疗一直是一个难题。从抗菌肽、植物次生代谢物及其他独特作用机制的新药等三方面进行阐述,以期为抗金黄色葡萄球菌感染的新药研发提供新的思路。     

吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的转录组影响分析

【背景】金黄色葡萄球菌是目前食品和临床引起感染的重要病原菌,迫切需要开发新型抗菌药物。【目的】分析吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的转录组影响和主要代谢信号通路。【方法】采用液体稀释法测定P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。将终浓度2 μg/mL的配合物分别作用于对数生长期的金黄色葡萄球菌30 min和2 h,进行转录组测序及分析。【结果】 P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为2 μg/mL和4 μg/mL。与空白对照相比,配合物处理细菌30 min后,其差异基因共有356个,其中上调表达180个、下调表达176个;配合物处理细菌2 h后,其差异基因共有23个,其中上调表达3个、下调表达20个。差异基因功能主要富集于膜的组成部分、细胞质、质膜、ATP结合、发病机制、金属离子结合、组氨酸生物合成过程、DNA结合、水解酶活性、跨膜转运蛋白活性、硝酸盐同化、硝酸盐代谢过程、硝酸还原酶复合物、硝酸还原酶活性等。差异基因涉及的信号通路主要有双组分系统、群体感应、氮代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢等。【结论】影响细菌质膜组成、毒素生成、生物膜形成、细胞壁合成、能量代谢等可能是吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的主要抑菌作用。研究为揭示吡唑啉酮铜配合物抑制金黄色葡萄球菌分子机制提供了理论依据。     

金黄色葡萄球菌病防治研究进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)被认为是最常见的食源性致病菌之一,引起人畜的感染性疾病,导致皮肤、软组织和血液感染,引发脓毒症和中毒性休克综合征。随着抗生素的滥用,金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐增强,导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的出现,并且在全球范围内散播,严重危害公共卫生安全。目前亟需有效控制SA感染的新疗法,因此本文对金黄色葡萄球菌防治技术的研究进展进行综述,并对其防治前景进行了分析,以期对金黄色葡萄球菌尤其是MRSA的控制提供理论指导。     

功能作图(functional mapping)分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的竞争互作

【背景】功能作图(functionalmapping)模型是基于统计方法的分析生物体动态复杂性状发育的全基因组作图方法,旨在定位性状发育过程中的数量性状位点(quantitative trait loci, QTL),将功能作图应用于微生物研究有助于解析复杂的互作过程。【目的】利用功能作图定位两种微生物在动态生长发育过程中发挥显著作用的QTL,通过基因功能注释找到影响微生物表型生长的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各100个菌株单独培养和一一配对共同培养,将取得的各菌株生长丰度表型数据和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)数据进行关联分析,找到同一物种在不同培养条件下对生长起作用的显著QTL。【结果】通过功能作图分析,在大肠杆菌中定位到217个QTL,金黄色葡萄球菌中定位到152个QTL;通过功能聚类和基因注释分析发现,QTL所在候选基因中金黄色葡萄球菌scdA、sdrC、sdrD、ftsA和大肠杆菌phr、nagC、eptA、ppsA、priA、flim基因对微生物的生长发挥了较大作用。【结论】本文借助功能作图定位了大肠杆菌和金黄...     

万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌(VISA/hVISA)的研究进展

万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌(VISA/hV ISA)日益增多,已经成为公共健康的重要威胁。来自临床或实验室的VISA/hV ISA菌株表现出一些共同特征,如细胞壁增厚,自溶活性降低,毒力减弱,醋酸盐代谢异常。金葡菌从VSSA到VISA/hV ISA的转化是一个逐步演变的过程,VISA中一些调控基因的变异,特别是如wal KR、graRS、vra SR、rpo B、rpo C、rpo D、agr、msrR、fdh2、sle1等基因连续的变异与金葡菌对万古霉素的耐药性相关。VISA/hV ISA中相应基因的变异也是VISA/hV ISA对宿主毒力减弱,持续定殖及对宿主适应性改变的遗传基础。为了预防和控制VISA/hI VSA感染,应全面了解其生物学特性,开发简便有效的检验方法,探索制定灵活的治疗策略,达到有效防治的目的。     

一株金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱特异性和分子分类研究

[目的]从医院污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体,观察其形态,确证裂解谱特征并研究生物学和基因学特性,为噬菌体的临床应用奠定实验基础.[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC25923作为宿主菌,采用双层琼脂平板法从医院污水中分离纯化噬菌体,电镜下观察形态并测定其最佳感染复数、一步生长曲线及裂解谱;全基因组测序并进行基因结构分析和...