金黄色葡萄球菌OatA基因敲除菌株及其回补菌株的构建

目的:构建金黄色葡萄球菌(金葡菌)Oat A基因敲除菌株及其回补菌株。方法:以p BT2为载体,构建金葡菌Oat A基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经金葡菌RN4220修饰后电转入金葡菌USA300,利用p BT2载体对温度敏感的特点,在42℃多次传代,筛选出金葡菌Oat A基因敲除菌株。以p LI50为载体,构建p LI50-Oat A全基因回补质粒,电转入金葡菌RN4220,再次抽提后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因回补菌株p Oat A。结果:成功构建基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经RN4220修饰电转入USA300,经PCR及测序鉴定,获得了金葡菌Oat A敲除菌株△Oat A。经PCR及酶切鉴定,确认p LI50-Oat A回补质粒构建成功,通过金葡菌RN4220修饰后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因敲除回补菌株p Oat A。结论:成功构建金黄色葡萄球菌Oat A基因敲除菌株及其回补菌株,为进一步研究金葡菌Oat A的功能及其作用机制奠定基础。     

基于Cre/loxP系统的睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠模型的构建及敲除效率检测

极长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLC-PUFAs)是哺乳动物视网膜、睾丸等极少数组织中特有的脂肪酸,其生物合成的关键酶为极长链脂肪酸延长酶4(very long chain fatty acid elongase 4,Elovl4)。建立组织特异性敲除Elovl4基因的动物模型有利于深入研究VLC-PUFAs的生物学功能,因此,本研究基于Cre/loxP系统,先分别构建了Stra8-Cre小鼠和Elovl4 floxed小鼠,通过杂交获得(Elovl4[flox/+],Stra8-Cre)杂合子基因敲除小鼠,再选择雌鼠与Elovl4 floxed纯合子雄鼠即Elovl4 [flox/flox]雄鼠杂交,通过基因型鉴定筛选获得(Elovl4[flox/flox], Stra8-Cre)纯合子小鼠。利用RT-PCR、qRT-PCR、Western blotting、免疫组化和免疫荧光检测Elovl4在睾丸组织中的敲除效率,结果表明,无论是杂合子还是纯合子基因敲除小鼠,其睾丸组织中Elovl4的表达在mRNA及蛋白水平显著下调,但其他组织未受影响。本研究成功构建了睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠,为后续研究VLC-PUFAs对雄性小鼠生殖功能的影响及相关分子机制提供可靠的动物模型。     

金黄色葡萄球菌中PVL基因与噬菌体DNA的同源性*

为了探讨金黄色葡萄球菌PVL基因与噬菌体的相关性 ,从 4株含有PVL基因的菌株中分离出DNA ,用HindⅢ或EcoRⅠ酶切后 ,分别与PVL和LukM-lukF-PV探针进行Southern印迹杂交 ,以及对含有PVL基因及其下游区域的片段克隆、测序和同源性分析。结果表明3株菌的PVL基因及其下游区域的序列与V8菌株噬菌体∮PVL的PVL基因及其下游噬菌体attsite的序列     

以agr基因为靶点快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

旨在建立一种以agr基因为靶点,快速检测金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增（LAMP)方法。针对金黄色葡萄球菌附属基因调控基因agr序列,设计了4条特异性引物;优化了LAMP体系中甜菜碱、dNTP浓度、长短引物比等因素;通过对14株不同金黄色葡萄球菌菌株和4株其他常见食品致病菌株进行检测,评估引物特异性。结果表明,在Mg²⁺浓度为2.4 mmol/L,dNTP浓度为0.8 mmol/L,甜菜碱浓度为0.1 mol/L,长短引物比为1:8,65 ℃反应50 min条件下扩增可达最佳效果。优化后的LAMP对14株金黄色葡萄球菌均表现为阳性,对4株非金黄色葡萄球菌菌株表现为阴性,证明引物具有特异性。本文首次利用agr基因作为靶基因片段,建立了一个简单、快速、特异性强的检测金黄色葡萄球菌的方法,在食品安全检测方面极具意义。     

sgf73基因敲除对粟酒裂殖酵母细胞有丝分裂的影响

sgf73基因编码的Sgf73蛋白对SAGA复合物的功能具有重要作用。为探究sgf73基因缺失后sgf73Δ菌株有丝分裂中纺锤体、染色体、肌动蛋白的动力学变化,以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为材料,对sgf73Δ菌株进行生长曲线和减数分裂产孢实验;采用荧光蛋白标记和活细胞成像的方法,对sgf73Δ菌株有丝分裂进行观察。生长曲线结果分析发现,sgf73基因敲除极显著影响粟酒裂殖酵母的生长,并导致子囊孢子数目显著减少。活细胞成像结果分析发现,在有丝分裂间期,sgf73Δ菌株微管数量显著增加、微管长度趋于增长但无显著差异;sgf73Δ菌株在分裂期纺锤体出现组装缺陷,单极纺锤体极显著增加,前期和中期纺锤体伸长速率显著下降、后期纺锤体伸长速率极显著下降、分裂中期和后期时间分别显著和极显著延长,有丝分裂总时间极显著延长,细胞长度也增长。肌动蛋白分裂环在有丝分裂中维持及收缩时间出现极显著和显著延长,总速率显著降低。同时,染色体分离出现缺陷。以上结果表明,sgf73基因缺失会导致菌株微管、染色体、肌动蛋白缺陷。     

棕色固氮菌nifS敲除菌株的构建*

从Azotobacter vinelandii中通过PCR扩增了5’和3’端分别缺失264bp和261bp的nifS′片段,克隆至载体pUC18,形成重组质粒pUCS,再通过同源重组的方法,将pUCS插入Azoto-bacter vinelandii的nifS中,形成nifS阻断突变体SU1,经Southern杂交和PCR扩增,证明所得确为nifS阻断突变株。SU1在外加氮源的BBGN培养基中能够快速生长,但在Burk's无氮培养基中,生长却极其缓慢     

Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统的构建及初步验证

【目的】构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因(Pyruvate decarboxylase,PDC)对该系统进行初步验证。【方法】以gfpm(绿色荧光蛋白基因)为报告基因,通过添加相应诱导剂评估Spathaspora passalidarum来源启动子(SpXYLp、SpMAL6p、SpMAL1p、SpGAL1p)和Saccharomyces cerevisiae来源Sc GAL1p启动子在C.amazonensis中的诱导调控性能。选择严格诱导型启动子调控FLP重组酶的表达,并在FLP表达盒和潮霉素(Hygromycin B)抗性标记基因(hphm)两端添加同向重复的FRT位点,以PDC基因作为靶基因构建敲除盒PRFg HRP,转化宿主菌C.amazonensis CBS 12363,筛选得到阳性转化子后,通过添加诱导剂,表达FLP重组酶,实现FRT位点间片段切除。【结果】诱导调控实验表明启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)和SpMAL1p(受麦芽糖诱导)是适用于C.amazonensis的严格诱导型启动子。以SpGAL1p调控FLP基因表达,构建的敲除盒PRFg HRP成功转化宿主菌,获得阳性转化子C.amazonensis PDC01,通过添加半乳糖诱导,成功切除基因组中FLP表达盒和抗性标记盒,获得突变株C.amazonensis PDC02。【结论】首次建立了一个适用于C.amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并利用该系统成功敲除了C.amazonensis内的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造C.amazonensis酵母奠定了良好基础。     

马尾松PmPGK1和PmGPIC基因的克隆和表达分析

为了解马尾松（Pinus massoniana）磷酸甘油酸激酶1（PGK1）与胞质溶胶葡萄糖磷酸异构酶（GPIC）的功能，采用RACE技术克隆了PmPGK1和PmGPIC基因，并进行了生物信息学分析与亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR技术分析PmPGK1和PmGPIC的表达特性。结果表明，PmPGK1和PmGPIC全长为2 106和1 848 bp，分别编码507和566个氨基酸。PmPGK1和PmGPIC分别定位于叶绿体和胞质溶胶。PmPGK1表达量为新叶 > 老叶 > 新茎 > 根 > 花；而PmGPIC为老叶 > 花 > 新叶 > 新茎 > 根。低温胁迫24 h，PmPGK1和PmGPIC的表达量均随时间延长先降低后升高，且PmGPIC的表达量在处理2 h后即降至较低水平；高浓度CO₂胁迫24 h，PmPGK1的表达量随时间延长呈降低-升高-再降低的变化趋势，PmGPIC的表达下调但变化较不显著。因此，推测PmPGK1主要参与卡尔文循环及叶绿体/质体糖酵解，PmGPIC主要参与细胞质基质糖酵解；PmPGK1、PmGPIC活性在低温胁迫下均受抑制；PmPGK1活性在CO₂胁迫下受到显著抑制，而PmGPIC活性的影响不大。     

生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的耐药特征、毒力基因及agr分型

为研究市售生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染状况,分两个季节从雅安市雨城区采集351份生鲜猪肉样本,采用K-B法检测分离株的耐药性,PCR技术对分离株的mecA基因、传统肠毒素基因、中毒休克综合征毒素基因、杀白细胞毒素基因、溶血素基因和脱皮毒素基因进行分析和agr分型。结果表明,夏、冬季总体检出率分别为15.28%和28.69%;分离株对青霉素、四环素、红霉素的耐受性最强;5种传统肠毒素的检出率为80%,sea、sed的检出率均为4.11%,seb、sec的检出率均为12.33%;中毒休克综合征毒素基因的检出率为15.07%,溶血毒素基因检出率最高,杀白细胞毒素基因和脱皮毒素基因检出率最低。分离株以agrⅠ型为主（50.68%）,未检测出agrⅣ 。综上表明,该地区生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染较为严重,分离株呈多重耐药谱,毒力基因分布多样,部分菌株致病性较强,具有的潜在危险应引起重视。     

番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌(VISA/hVISA)的研究进展

万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌(VISA/hV ISA)日益增多,已经成为公共健康的重要威胁。来自临床或实验室的VISA/hV ISA菌株表现出一些共同特征,如细胞壁增厚,自溶活性降低,毒力减弱,醋酸盐代谢异常。金葡菌从VSSA到VISA/hV ISA的转化是一个逐步演变的过程,VISA中一些调控基因的变异,特别是如wal KR、graRS、vra SR、rpo B、rpo C、rpo D、agr、msrR、fdh2、sle1等基因连续的变异与金葡菌对万古霉素的耐药性相关。VISA/hV ISA中相应基因的变异也是VISA/hV ISA对宿主毒力减弱,持续定殖及对宿主适应性改变的遗传基础。为了预防和控制VISA/hI VSA感染,应全面了解其生物学特性,开发简便有效的检验方法,探索制定灵活的治疗策略,达到有效防治的目的。     

抗金黄色葡萄球菌感染的新药研究进展

金黄色葡萄球菌因抗菌药耐药性而引起广泛关注,其耐药株感染所引起的皮肤和软组织感染、肺炎、菌血症以及骨髓炎等增加了患者的发病率和死亡率。金黄色葡萄球菌通常通过携带多种耐药基因、毒力基因或形成生物被膜等方式快速适应生存环境而产生耐药性,使得常规抗菌药物难以达到理想的治疗效果,因此,金黄色葡萄球菌感染的治疗一直是一个难题。从抗菌肽、植物次生代谢物及其他独特作用机制的新药等三方面进行阐述,以期为抗金黄色葡萄球菌感染的新药研发提供新的思路。     

金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的免疫治疗策略

金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins,SEs）是由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的一类具有呕吐活性的细菌外毒素，可引起严重的炎症反应和食物中毒。SEs具有超抗原活性，可与T细胞受体的可变区和MHC II类分子形成三元复合物（TCR-SEs-MHC II），直接刺激T淋巴细胞大量产生肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素（interleukin,IL）-2、IL-6和γ干扰素（interferon γ,IFN-γ）等细胞因子，从而导致中毒性休克综合征（toxicshocksyndrome, TSS）。在临床常见的SEs中，肠毒素A (staphylococcalenterotoxin A, SEA)和肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)是出现频率最高、毒性最大、危害最严重的两种。目前尚没有针对SEs中毒治疗策略的综述性研究。本文首先概述了SEs的分类、结构及毒性作用，重点围绕SEA和SEB，分析了TCR-SEs-MHC II类...     

吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的转录组影响分析

【背景】金黄色葡萄球菌是目前食品和临床引起感染的重要病原菌,迫切需要开发新型抗菌药物。【目的】分析吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的转录组影响和主要代谢信号通路。【方法】采用液体稀释法测定P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。将终浓度2 μg/mL的配合物分别作用于对数生长期的金黄色葡萄球菌30 min和2 h,进行转录组测序及分析。【结果】 P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为2 μg/mL和4 μg/mL。与空白对照相比,配合物处理细菌30 min后,其差异基因共有356个,其中上调表达180个、下调表达176个;配合物处理细菌2 h后,其差异基因共有23个,其中上调表达3个、下调表达20个。差异基因功能主要富集于膜的组成部分、细胞质、质膜、ATP结合、发病机制、金属离子结合、组氨酸生物合成过程、DNA结合、水解酶活性、跨膜转运蛋白活性、硝酸盐同化、硝酸盐代谢过程、硝酸还原酶复合物、硝酸还原酶活性等。差异基因涉及的信号通路主要有双组分系统、群体感应、氮代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢等。【结论】影响细菌质膜组成、毒素生成、生物膜形成、细胞壁合成、能量代谢等可能是吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的主要抑菌作用。研究为揭示吡唑啉酮铜配合物抑制金黄色葡萄球菌分子机制提供了理论依据。     

表皮葡萄球菌vraSR-srrAB突变株的构建及生物学表型

【背景】形成生物被膜是表皮葡萄球菌的主要致病方式,双组分系统(two-component regulatory system, TCS) VraSR和SrrAB与细菌的生长、生物被膜形成等多种生物学表型密切相关。敲除表皮葡萄球菌SE1457 vraSR后细胞壁变薄,生物被膜形成量降低,而敲除srrAB后生长进入稳定期的时间延长,生物被膜形成量也降低,且TCS-VraSR和SrrAB均通过ica途径调控表皮葡萄球菌生物被膜的形成。ica操作子是表皮葡萄球菌生物被膜形成的重要调节元件,由icaADBC这4个开放阅读框(openreadingframe,ORF)和1个转录方向相反的icaR组成,IcaR是icaADBC的抑制子。【目的】探索TCS-VraSR和SrrAB协同调控表皮葡萄球菌生长及生物被膜形成中的作用,为防控表皮葡萄球菌引起的持续性感染奠定基础。【方法】构建pKOR1-ΔvraSR重组质粒,经大肠杆菌DC10B修饰后转入ΔsrrAB,通过同源重组在ΔsrrAB突变株的基础上进一步敲除vraSR基因,疑似ΔvraSR-srrAB突变株经PCR、RT-PCR和测序验证。检测Δvra...     

金黄色葡萄球菌病防治研究进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)被认为是最常见的食源性致病菌之一,引起人畜的感染性疾病,导致皮肤、软组织和血液感染,引发脓毒症和中毒性休克综合征。随着抗生素的滥用,金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐增强,导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的出现,并且在全球范围内散播,严重危害公共卫生安全。目前亟需有效控制SA感染的新疗法,因此本文对金黄色葡萄球菌防治技术的研究进展进行综述,并对其防治前景进行了分析,以期对金黄色葡萄球菌尤其是MRSA的控制提供理论指导。     

功能作图(functional mapping)分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的竞争互作

【背景】功能作图(functionalmapping)模型是基于统计方法的分析生物体动态复杂性状发育的全基因组作图方法,旨在定位性状发育过程中的数量性状位点(quantitative trait loci, QTL),将功能作图应用于微生物研究有助于解析复杂的互作过程。【目的】利用功能作图定位两种微生物在动态生长发育过程中发挥显著作用的QTL,通过基因功能注释找到影响微生物表型生长的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各100个菌株单独培养和一一配对共同培养,将取得的各菌株生长丰度表型数据和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)数据进行关联分析,找到同一物种在不同培养条件下对生长起作用的显著QTL。【结果】通过功能作图分析,在大肠杆菌中定位到217个QTL,金黄色葡萄球菌中定位到152个QTL;通过功能聚类和基因注释分析发现,QTL所在候选基因中金黄色葡萄球菌scdA、sdrC、sdrD、ftsA和大肠杆菌phr、nagC、eptA、ppsA、priA、flim基因对微生物的生长发挥了较大作用。【结论】本文借助功能作图定位了大肠杆菌和金黄...     

馒头中金黄色葡萄球菌生长预测模型的建立

以传统面制品馒头作为研究对象,采用修正的Gompertz（SGompertz）和修正的Logistic（SLogistic）作为一级生长模型,应用Origin 9.0软件分别拟合馒头中金黄色葡萄球菌在10、15、25、30和37 ℃的生长情况,获得其最大比生长速率（μ_max）和迟滞期(λ)。采用平方根模型和二次多项式模型建立馒头中金黄色葡萄球菌的二级生长模型,并对该模型进行验证。结果表明,SGompertz模型能较好地拟合馒头中金黄色葡萄球菌的生长。以μ_max建立的平方根和二次多项式模型,R²分别为0.931 5和0.932 0,偏差因子（B_f）分别为1.123 2和1.050 1,准确因子（A_f）分别为1.221 0和1.190 2,表明采用μ_max进行拟合时,二次多项式模型的拟合效果较好;以迟滞期λ建立的平方根和二次多项式模型,R²分别为0.948 4和0.969 6,B_f分别为0.890 1和0.912 2,A_f分别为1.541 1和1.180 3,表明采用迟滞期λ进行拟合时,二次多项式模型的拟合效果较好。本研究可为馒头等传统面制品的定量风险评估提供参考。