绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys 及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C 末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N端的一个,而近C端的活性区域经CNBr裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N 端的一个,而近C 端的活性区域经CNBr 裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N 末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C 末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH 下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH 低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH 下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK 值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与功能

本文介绍了三种丝氨酸蛋白酶抑制剂。绿豆胰蛋白酶抑制剂与慈菇蛋白酶抑制剂均为双头抑制剂,分别由72与141个氨基酸残基所组成。绿豆抑制剂能被胃蛋白酶降解为活性中心分别为Lys及Arg的两个活性碎片,其抑制剂本身及Lys碎片的晶体结构已阐明。慈菇抑制剂有A、B两个主要组份,两者对不同蛋白酶有不同抑制活性,是一种新类型的抑制剂。天花粉胰蛋白酶抑制剂是迄今已知的最小多肽抑制剂,共含27个氨基酸残基,用2D-NMR研究了它的构象。讨论了上述三种抑制剂的异同。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氨基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨肽酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂与猪胰蛋白酶复合物分子在四方和三方两种不同晶体中的取向关系

用Crowther的快速旋转函数研究了绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBI)-猪胰蛋白酶(PTRY)复合物的四方晶体和三方晶体中胰蛋白酶分子的取向关系,并得出了它们之间的旋转矩阵。此旋转矩阵能和从胰蛋白酶模型分子为出发点在四方和三方晶体中所求得的胰蛋白酶分子的取向相互印证。此结果将促进绿豆胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶的复合物立体结构及它们在不同晶形中的差异的研究。     

猪胰蛋白酶自溶产物中δ-、γ-和σ-胰蛋白酶的分离与结晶

将1％猪胰蛋白酶溶于0.05M,pH9.0硼酸缓冲液中,在25℃自溶6小时后,上大豆胰蛋白酶抑制剂亲和层析柱STI-Sepharose4B,用pH5.0—3.0的磷酸钾缓冲液梯度洗脱,可以有效地分开各种自溶活性产物。从得到的三个活性峰S_1、S_2和S_3中,用DNS-Cl Edman法和有色Edman法测定酶分子肽键断裂后N末端的部分氨基酸顺序,从而鉴定出三种不同形式的自溶活性产物:δ~-、γ~-和σ~-胰蛋白酶。S_3主要含有完整的单链β-胰蛋白酶;S_2主要含有Arg_(105)—Val_(156)断裂的双链δ-胰蛋白酶;S_1含有Arg_(105)—Val_(106),Lys_(145)—Arg_(146)和Arg_(105)—Val_(106),Lys_(131)—Ser_(132)断裂的三链γ-和σ-胰蛋白酶。活性产物的几个N端氨基酸顺序与已知猪胰蛋白酶氨基酸顺序完全相符。 与β-胰蛋白酶相比,δ~-、γ~-和σ~-胰蛋白酶的等电点稍有降低,约为10.5左右。 对分离出的自溶活性产物的结晶条件进行了摸索,用悬滴法已经得到δ~-、γ~-和σ~-胰蛋白酶与苯甲脒复合物的结晶。这是关于分离出胰蛋白酶自溶活性产物结晶体的首次报道。     

用单链和PCR相结合的方法合成绿豆胰蛋白酶抑制剂基因

本文报道用单链与PCR技术相结台的合成方法合成了胰蛋白酶抑制剂基因,包括氨基酸编码顺序、起始和终止密码子,上、下游两端的EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ限性酶识别顺序等全长共248个碱基对。合成基因的编码是参考其它植物的蛋白酶抑制剂基因的同源编码和植物基因的偏爱密码子来进行设计的。合成的基因双链经限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ在两端切出粘性末端后克隆到pUCl9中,克隆基因结构的正确性经过限制酶图谱和DNA序列分析得到完全的证明。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)_慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)_用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)_测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氮基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)_用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨呔酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

吸血诱导的埃及伊蚊海口株后期胰蛋白酶基因测序及与美国株同源性比较

应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从吸血后24 h埃及伊蚊海口株总RNA中扩增出了后期胰蛋白酶编码区cDNA序列。采用自动DNA分析仪进行序列分析,并与已知埃及伊蚊美国株后期胰蛋白酶基因及推导的氨基酸序列进行了同源性比较。结果表明：埃及伊蚊海口株后期胰蛋白酶基因序列与美国株同源性达98%,有11个碱基发生变异;氨基酸同源性达99%,仅有3个氨基酸发生变异,但与催化位点密切相关的氨基酸及N末端氨基酸序列完全一致。以上结果显示,埃及伊蚊胰蛋白酶不同地理株间存在微小的差异。     

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅱ.抑制剂A、B组份的关系及其化学结构的特征

前文曾报导自绿豆中抽提出两种结晶胰蛋白酶抑制剂A和B。但在制备过程中有时观察到A、B组份的比例有所改变,若A增多则B减少,反之亦然;若在热TCA中处理过份激烈,A有时又可一分为二。这是由于组織中确有两种或更多的组份存在,还是由于在制备过程中条件比较激烈,人为地由同一组份派生而来?为求确定此问题,我们在抽提过程中逐步观察了组份A和B间的关系,发现A确是由B派生而来。A和B的氨基酸组成和N末端完全相同,仅在酰胺含量上有所差别。我们还分析比较了抑制剂化学结构上的若干特点。     

用圆二色性探测绿豆胰蛋白酶抑制剂的构象

绿豆胰蛋白酶抑制剂的紫外圆二色谱与一般球状蛋白质不同,属典型的Bowman-Birk抑制剂的图形,具有231nm正峰,245nm肩,275nm负峰及202nm大负峰。异硫氰酸苯酯修饰Lys活力中心后,使抑制剂失去一半活力,但CD谱变化不大。溴化氰处理后,抑制剂Arg活力区破坏,231nm峰消失,202nm峰变小。这两个峰可能与抑制剂特定的硫-硫键构象有关。研究了此抑制剂及上述衍生物与羊胰蛋白酶形成的络合物的CD谱。从CD谱看,羊胰蛋白酶属无规卷曲。络合物CD谱与两游离组分CD谱的加和谱比,有一些不同,但大体上是相似的。因此,络合物中两组分的构象与游离时的构象大体上相似。     

用圆二色性探测绿豆胰蛋白酶抑制剂的构象

绿豆胰蛋白酶抑制剂的紫外圆二色谱与一般球状蛋白质不同,属典型的Bowman-Birk抑制剂的图形,具有231nm正峰,245nm肩,275nm负峰及202nm大负峰。异硫氰酸苯酯修饰Lys活力中心后,使抑制剂失去一半活力,但CD谱变化不大。溴化氰处理后,抑制剂Arg活力区破坏,231nm峰消失,202nm峰变小。这两个峰可能与抑制剂特定的硫-硫键构象有关。研究了此抑制剂及上述衍生物与羊胰蛋白酶形成的络合物的CD谱。从CD谱看,羊胰蛋白酶属无规卷曲。络合物CD谱与两游离组分CD谱的加和谱比,有一些不同,但大体上是相似的。因此,络合物中两组分的构象与游离时的构象大体上相似。     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

广西眼镜王蛇毒神经毒素的一级结构

本文报道广西眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)毒神经毒素(CM-9)的氨基酸顺序测定。应用固相DABITC-PITC双偶合-Edman手工降解法能对完整的还原S-羧甲胺甲基化CM-9从N端降解至第51位。联结经双向纸层析电泳纯化的用胰蛋白酶裂解肽段的顺序,完成含73个氨基酸残基的全部顺序。CM-9的顺序与Joubert报道的泰国眼镜王蛇神经毒素的顺序基本相似。整个顺序中有18%氨基酸残基不同,特别在C端四位残基有很大差别,颇与银环蛇α-毒素的C端的疏水性十分相似。     

蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL^-1的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5%、41.2%和38.7%,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20%时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.     

绿豆胰蛋白酶抑制剂┐猪胰蛋白酶复合物的四方晶体结构

本文报道了绿豆胰蛋白酶抑制剂－猪胰蛋白酶（１∶２）复合物的四方晶体的结构测定。晶体属于Ｉ４２２空间群,衍射分辨率为０．２５ｎｍ,共确定了绿豆抑制剂５６个残基的空间位置。与已报道的三方晶体结构相比,其中的抑制剂分子的结构基本相同,并且抑制剂－酶三元复合物在四方晶体中也处于堆积无序状态,即复合物按两种取向进行堆积：Ｔａ∶ＭａＭｂ∶Ｔｂ和Ｔｂ∶ＭｂＭａ∶Ｔａ（Ｔａ,Ｔｂ为胰蛋白酶,Ｍａ为抑制剂结合环Ⅰ,Ｍｂ为抑制剂结合环Ⅱ）。但四方晶体结构比三方晶体结构多测定了一个抑制剂残基Ｐｒｏ１１的位置,同时,四方晶体中的抑制剂不存在膺β－折叠片层结构,其构象与三方晶体中的抑制剂相比有所变化。分析表明抑制剂的两个刚性的结构域之间的连接肽具有一定的柔性,并因此形成不同的晶型。此外,绿豆抑制剂与其他Ｂｏｗｍａｎ－Ｂｉｒｋ抑制剂相比,分子的两个双股的反平行β－折叠片层和抑制活性位点所在的结合环的结构具有很高的保守性