■爱德华氏菌变异株C9605及对鳖的致病性研究

从患白板综合症的病鳖分离到一株细菌（C9605）,该菌为革兰氏阴性,直杆状,周生鞭毛。接触酶阳性,氧化酶阴性,还原硝酸盐,对多粘菌素不敏感,不利用柠檬酸盐和丙二酸盐作唯一碳源,不从甘露醇、蔗糖、海藻糖、L-阿拉伯糖产酸。根据这些特性,菌株可归于爱德华氏菌。但是该菌发酵木糖产酸,产生H2S,耐青霉素,故鉴定为爱德华氏菌变异株（Edwardsiellaictalurivariationstrain）。人工感染实验证实,该菌株是鳖白板综合症的病原菌。     

Hui爱德华氏菌变异株C9605及对弊的致病性研究

从患白板综合症的病鳖分离到一株细菌（Ｃ９６０５）,该菌为革兰氏阴性,直杆状,周生鞭毛。接触酶阳性,氧化酶阴性,还原硝酸盐,对多粘菌素不敏感,不利用柠檬酸盐和丙二酸盐作唯一碳源,不从甘露醇、蔗糖、海藻糖、Ｌ－阿拉伯糖产酸。根据这些特性,菌株可归于Ｈｕｉ爱德华氏菌。但是该菌发酵木糖产酸,产生Ｈ２Ｓ,耐青霉素,故鉴定为Ｈｕｉ爱德华氏菌变异株。人工感染实验证实,该菌株是鳖白板综合症的病原菌。     

鳗鲡爱德华氏病的研究

本文记述了在我国新发现的鳗鲡爱德华氏病的症状和病原菌的特征。病鱼的症状表现为两大类型,以肾脏病变为主的肾脏型和以肝脏病变为主的肝脏型。从病鱼的内脏分离到7株菌,用其中的E86～205进行人工感染,100％的鳗鲡死亡,与自然发病的症状相似,从感染的鳗鲡上又重新分离到菌株E86-203。E86-203与E86-205以及其他菌株的特征也都一致。均为革兰氏阴性杆菌。菌体直,两端圆形,单个,大小为0.6—0.8×0.8—2.4微米。周鞭毛,运动,兼性厌氧,发酵葡萄糖产酸产气。氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,产生硫化氢。不能利用柠檬酸盐和丙二酸盐作为唯一的碳源,精氨酸脱氢酶阴性,赖氨酸脱羧酶阳性。属爱德华氏菌属的细菌。但是鸟氨酸脱羧酶阴性,能迅速利用纤维糖,不同于已报道的三个种(Edwardsiella tarda Ewing and McWhorter 1965,E.hoshinae Grirnont 1980,E.ictaluri Hawke 1981)中任何一个种,因此认为E86-205等菌株为一新种,定名为福建爱德华氏菌(Edwardsiella fujianensis sp.nov.)。     

迟钝爱德华氏菌的保存方法

比较了7种不同方法保存迟钝爱德华氏菌的效果。测定存活力、毒力和生物学特性的结果表明,采用30％甘油PBS液保存该菌的效果较好。     

鳗鲡爱德华氏菌病的组织病理学研究

鳗鲡爱德华氏菌病病变性质为化脓性炎症。症理分型主要有两种：化脓性肝炎型、混合型。较早发生病变部位主要在肝脏,其化脓性病杜按病程分为初、中、晚期。肾脏、脾脏、胃粘膜、体表出现散在的脓肿、脓性溃疡、炎性血栓及血斑。此外,肝脏、肾脏实质细胞均出现变性和坏列、血管充血、出血等。本文详细报告了肝脏、脾脏、肾脏的超微结构变化并初步讨论了细胞、组织损伤的过程及细胞病理学、超微病理学意义。     

迟钝爱德华氏菌菌蜕系统的构建

菌蜕系统（Bacterial Ghost,BG）的形成是利用噬菌体PhiX174的裂解蛋白E在革兰阴性菌细胞膜形成一个跨膜孔道结构,使细菌胞内物质由孔道排出而引起死亡。这种基因灭活的过程不引起细菌表面结构的任何理化变性,因此生成的细菌空壳具有与活菌相同功能的膜抗原结构,可诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答。检测和比较了在铁调控启动子PyncE和温度调控启动子PR/cI控制下的E基因对迟钝爱德华氏菌菌蜕系统（EBG）的生成效率。结果显示,2种启动子均能成功生成EBG,电镜下可观察到细菌两端有直径约为80～400 nm的孔洞。传统菌蜕系统所用的热启动子在诱导后3 h开始裂解,8 h后细菌停止死亡;而新型铁诱导启动子在诱导后2 h细菌即完全停止生长。本研究为将来开发菌蜕载体疫苗防治爱德华氏菌症奠定了基础。     

48株爱德华氏菌糖酵解持家酶的胞外分泌

【背景】病原菌的糖酵解持家酶能分泌到胞外或定位在细胞膜表面,在病原菌的侵染和细胞粘附方面发挥着重要作用,爱德华氏菌是重要的鱼类致病菌,研究其糖酵解持家酶的胞外分泌有助于该病原的致病机制研究和疫苗开发。【目的】探究爱德华氏菌中糖酵解持家酶的胞外分泌。【方法】通过ELISA方法考察48种不同来源的爱德华氏菌中5种糖酵持家酶的胞外分泌。【结果】48种不同来源的爱德华氏菌中糖酵解持家酶蛋白均能分泌到胞外。【结论】爱德华氏菌中糖酵解持家酶的胞外分泌是普遍现象。     

美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌分离、鉴定及致病性研究

养殖美洲黑石斑(Centropristis striata)发生以“内脏白点”为主要临床症状的暴发性死亡, 为明确美洲黑石斑患病原因, 对患病鱼进行了病原分离、鉴定及致病性研究, 以期为防治美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌病提供参考依据。患病的美洲黑石斑的症状主要表现为鳃和内脏组织如脾脏及肾脏上布满白点。从患病鱼的病灶处分离纯化到一株优势致病菌株(ZS201807), 通过对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因测序等综合分析, 鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实此菌株可引起健康美洲黑石斑发病并表现出与自然发病相似的症状。利用组织切片和电镜超薄切片技术对患病美洲黑石斑鱼的肝脏、脾脏、鳃丝等6种组织进行组织病理学分析。组织病理结果显示, 脾和肾是感染较严重的主要靶器官, 脾脏组织内大量红细胞浸润, 出现严重瘀血; 鳃丝毛细血管扩张; 肾小管管腔狭窄, 肾小球肿大, 上皮细胞肿胀, 细胞空泡化。超微病理显示, 病鱼脾脏和头肾组织有大量杆状细菌积聚。药敏试验发现该菌对环丙沙星(5 μg/片)、四环素(30 μg/片)、恩诺沙星(5 μg/片)等14种药物敏感; 对青霉素(10 U/片)、阿奇霉素(15 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)等13种药物耐受。证实此次养殖美洲黑石斑发病死亡的病原菌为迟缓爱德华氏菌。     

爱德华氏菌产乳酸氧化酶的条件研究

在以前工作的基础上,对已获得的产乳酸氧化酶的5株菌进行复筛,对产酶量大的一株菌进行了分类鉴定,确定该菌株属迟钝爱德华氏菌生物群I(Edwardsiella tarda Biogroup I)。这与曾报道的产乳酸氧化酶分枝杆菌(Mycobacterium)和片球菌(Pediococcus)是不同的菌。分别研究了培养基中的培养初始pH、核黄素、乳酸钠以及硫酸铵对发酵产乳酸氧化酶的影响。这一酶源在酶法生产丙酮酸及医疗诊断和酶电极应用上有意义。     

迟缓爱德华氏菌对Hep-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭Hep—2细胞的基本特性。在15株来源各异的迟缓爱德华氏菌中,有6株细菌具有对Hep—2细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后,主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖,而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用,而且表现出剂量依赖关系,而用秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对Hep—2细胞的侵袭过程中,细胞骨架中有微丝的参与,未发现微管的参与。     

迟缓爱德华氏菌对Hep-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭ＨＥｐ－２细胞的基本特性。在１５株来源各异的迟缓爱德华氏菌中,有６株细菌具有对ＨＥｐ－２细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后,主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖,而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用,而且表现出剂量依赖关系,而在秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对ＨＥｐ－     

爱德华氏菌人工经口感染及病理观察

用从病鱼体内分离到的福建爱德华氏茵（Ｅｄａｗａｒｄｓｉｅｌｌａｆｕｊｉａｍｅｎｓｉｓ）人工经口感染鳗鲡获得成功,证明该菌由消化道传染。人工感染后一系列组织病理观察表明：该菌对肝脏的损害是致肝细胞融解形成灶性坏死,对肾脏引起造血组织增生。当继发感染气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏ－ｎａｓ）后,灶性坏死区形成脓肿。继发感染是爱德华氏病致死的原因,同时也是鳗鲡爱德华氏病症伏表现为肝脏型或肾脏型两种类型的原因。     

牙鲆迟钝爱德华氏菌感染症及其病原的研究

对 7起牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例进行了发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验 ,经对细菌的分离与鉴定表明所检病例均为迟钝爱德华氏菌的单独感染 ,系统归纳了该感染症的主要特点。同时 ,对所分离后做纯培养的 130株迟钝爱德华氏菌进行了主要生物学性状、血清型的测定 ,表明除在生化试验的吲哚项目中表明有株间差异 (阴性的 2 0株、阳性的 110株 )外 ,130株对其他所测内容的结果一致 ,130株均为同种血清型。从每起病例分离并鉴定的各 1个代表菌株做对健康牙鲆的人工感染试验 ,表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果表明 ,对供试 37种抗菌药物中的头孢唑啉等 19种药物敏感、对青霉素G等 5种药物耐药、对氨苄青霉素等 13种药物表现了株间差异。经以荧光抗体技术对纯培养物、人工感染病死鱼肝脏中细菌的检验 ,初步表明了荧光抗体技术在对迟钝爱德华氏菌检验中作为辅助检验手段的可行性。     

黄颡鱼鲇鱼爱德华氏菌的鉴定及生物学特性研究

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco),又称黄嘎、昂刺、黄腊丁等,隶属鲶形目(Siluriformes),鲿科(Bagridae),黄颗鱼属(Pelteobagrus),是我国重要的小型底层经济鱼类,在我国各大水系均有分布,特别在长江中下游的湖泊更为集中,是一种营养价值和药用价值都较高的优质淡水鱼类,也是出口创汇的优良品种。       

迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析

【目的】本研究旨在建立迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型,以提供疾病模型用于病理学、药理学和药物学研究。【方法】通过不同途径对斑马鱼进行人工感染,模拟自然感染状态,并研究迟缓爱德华氏菌对斑马鱼的致病机理,包括死亡率、行为变化、生化指标和病鱼机体抗氧化能力的变化情况。【结果】比较3种感染途径,显示腹腔注射的致病力最强。迟缓爱德华氏菌感染后,斑马鱼表现出眼球突出、肛门出血、溃疡和腹水等症状。病理检查显示,感染后的斑马鱼发生急性炎症,可见肝细胞广泛坏死脱落,肝小叶萎缩,周围见吞噬细胞聚集。从患病斑马鱼体内分离出TX菌株,并通过特异性引物聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定为迟缓爱德华氏菌,确定该菌的半致死浓度LD50为3.65×102菌落形成单位(colony forming units, CFU)尾。与对照组相比,注射感染组的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力降低22.26%,丙二醛(malondialdehyde, MDA)显著升高16倍,酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性和碱性磷酸...     

迟缓爱德华氏菌EcoRⅠ核糖体自动化分型与聚类分析

【目的】对26株迟缓爱德华氏菌进行自动化核糖体分型,并进行聚类分析。【方法】采用RiboprinterTM全自动微生物鉴定系统对分离自斑点叉尾鮰、日本鳗、多宝鱼、比目鱼、斑醴等宿主体内的迟缓爱德华氏菌进行核糖体分型,以限制性内切酶Eco RⅠ处理、切割菌株DNA;运用Bio Numerics软件分析图像数据。【结果】迟缓爱德华氏菌核糖体图谱与数据库中已有信息进行比对,ATCC15947和BYK00685的比对相似值0.85,分别为0.95及0.90。条形码经软件分析共产生21种核糖体条带,聚类分析分为3个群。条带之间呈现明显的地域性差异和宿主差别。来自北方及南方的菌株除少数几株以外,各自聚集为一个群;所有人源株则分布在第三群。【结论】自动化核糖体分型可以方便快捷地用于不同物种的菌株分型与流行病学追踪溯源。     

致病性迟缓爱德华菌的检测

系统检测了 2 5株迟缓爱德华菌 (Edwardasiellatarda ,Et)的胞外产物 (ECP) ,包括溶血素、胞外蛋白酶 (ECPase) ,并用Et强致病株JEL4的ECP抗血清作Dot ELISA检测各株Et的ECP ,同时对小鼠和剑尾鱼作致病性试验。试验表明 ,具动物致病性的菌株溶血素检测均为阳性 ,ECPase与致病性无关。JEL4ECP的Dot ELISA结果与动物致病性的符合率达 1 0 0 %。在此基础上 ,建立了致病性Et的检测方法 ,该方法只需作简便的平板溶血试验和Dot ELISA ,即可检测Et的ECP ,无须作动物试验 ,从而简化了致病性Et的检测程序 ,为研制检测试剂盒奠定了基础。     

迟钝爱德华氏菌RNA提取及痕量基因组DNA去除方法探究

迟钝爱德华氏菌EIB202是一类细胞壁结构特殊的革兰氏阴性菌,高质量RNA提取相对较难。为了从转录组水平研究这类致病菌的致病机理,需要摸索有效的RNA提取及RNA样品中痕量基因组DNA去除方法。对常规RNA提取步骤进行改进,增加PBS清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理等步骤;另外,利用小体系基因组DNA去除系统,Mg2+与Mn2+协同激活DNase I去除RNA样品中基因组DNA污染。利用优化方法提取的RNA在质量及浓度(1 740 ng/μL)方面均有了显著改善,并建立了一套完全去除RNA样品中痕量基因组DNA污染的程序。     

鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

【目的】探明上海某养殖场的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)发生死亡的病因,研究致病菌分类地位和毒力基因携带情况。【方法】通过病原菌的筛查和回感试验,确定发病原因,对16S rRNA基因、gyrB和rpoB管家基因测序,建立病原菌系统进化树,结合API-32E细菌鉴定系统对菌株的生理生化进行鉴定,综合判定致病菌的种类及其分类地位;根据已报道的7个毒力基因fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB序列,设计引物进行PCR扩增,研究病原菌毒力基因携带情况。【结果】致病菌GY15是导致异育银鲫发病的原因,GY15的16S rRNA、gyrB和rpoB基因与已报道的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)相似性在99%以上,构建系统进化树和API鉴定确定该菌株为E.tarda,腹腔注射回感可导致异育银鲫死亡,半致死浓度(LD_(50))为4.26×105 CFU/m L;已报道的7种毒力基因在该致病菌中均能被检测到;药敏试验结果显示,该菌对恩诺沙星、氟苯尼考和氧氟沙星等15种药物敏感,对新霉素、四环素和复方新诺明等18种药物表现为耐药。【结论】首次报道E.tarda可感染异育银鲫,它对异育银鲫的养殖造成威胁。     

黄颡鱼PGRP-L基因克隆及其对爱德华氏菌的反应

为了研究肽聚糖识别蛋白家族(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)先天免疫应答中发挥的作用, 根据NCBI中斑马鱼(Danio rerio) 和虹鳟(Oncorhynchus mykiss) PGRP-L的基因信息, 采用简并引物和RACE方法从黄颡鱼肝脏中克隆得到了一个长型PGRP (PfPGRP-L)基因. PfPGRP-L基因的全长cDNA序列大小为1617 bp, 其中5'和3'非翻译区的长度分别为135和72 bp, 开放阅读框为1410 bp, 编码469个氨基酸. 同源性和系统进化分析表明, 黄颡鱼PGRP-L与虹鳟的同源性为60%, 与脊椎动物的PGLYRP2 或PGRP-L聚在一起. 半定量RT-PCR分析发现PfPGRP-L基因在黄颡鱼鳃、胸腺、肝脏、脾脏、肠道、肾脏、头肾、心脏、血液和肌肉组织中均有分布, 但在肠道和脾脏中的表达量较为丰富, 而在肌肉和血液中表达则很少. 用爱德华氏菌刺激后, PfPGRP-L在肝脏、脾脏、肠道及头肾中的表达明显上调. 结果表明, PfPGRP-L在黄颡鱼抵抗病原菌中具有重要作用.