Prohibitin特异性MiRRNAi表达载体构建及其干扰效果测定

目的：构建携带prohibitin（PHB-1）基因的MiRRNAi真核表达载体pcDNA^TM 6．2-GW／EmGFP-MiR,并观察其转染HEK293细胞株前后PHB-1的表达变化。方法：根据GenBank中prohibifin的序列,设计特异的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,克隆至pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP-MiR质粒缺口末端,连接在质粒上生成含MiRRNAipcDNA^TM6．2．GW／EmGFP-MiR-PHB载体,测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至HEK293细胞中,用Westernblotting检测干扰后HEK293细胞内PHB-1表达的变化。结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。Westernblotting检测结果证实构建的PHB-1 MiR RNA表达重组体可显著抑制HEK293细胞内PHB-1的表达。结论：成功构建了携带PHB-1基因的MiR RNAi真核表达载体。     

β分泌酶RNA干扰质粒的构建与鉴定

选择人、小鼠和大鼠的BACEI基因的共有序列为干扰的靶标,设计4对干扰片段连接至带有GFP和U6 RNA聚合酶启动子的PRNATU6．1载体．将构建好的质粒转染HEK293T细胞,通过RT-PCR和Western blotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测BACEI和Aβ,以鉴定其干扰效率,并通过夹心ELISA的方法进一步在过表达蛋白APP和BACE1的HEK293T细胞体系中验证干扰质粒对Aβ1-42生成的影响．RT-PCR和Western blotting结果提示β分泌酶的siRNA能干扰BACE1和Aβ RNA和蛋白水平表达,效率分别达到90％和80％．Westem blotting和ELISA结果提示,β分泌酶的siRNA也降低Aβ1-42生成．     

鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV干扰载体的构建及筛选

旨在构建靶向鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV的siRNA表达载体,并在体外检测其对cNanog和cPouV表达的抑制作用。分别选择cNanog和cPouV中3个区域合成寡聚核苷酸构建siRNA表达载体,同时构建cNanog和cPouV全基因表达载体来检测基因表达下调的效果。经Western blotting检测显示,所构建的siRNA表达载体可在293T细胞内表达siRNA或shRNA,诱发RNA干扰效应,从而抑制目的基因cNanog和cPouV的表达。不同位点的寡核苷酸序列抑制效率不同,其中pS3-cNanog和pS3-cPouV重组质粒的干扰效果和抑制效率最好。研究结果为后续得到稳定干扰cNanog和cPouV基因的重组载体和进一步研究cNanog和cPouV基因功能奠定了基础。     

比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

泛素C端水解酶L1的RNA干扰载体的构建及效果评价

目的:获得抑制效果好的泛素 C 端水解酶 L1(UCH-L1)基小干扰 RNA(siRNA)干扰载体.方法:根据 Gen?Bank 中大鼠 UCH-L1基序列设计并合成4对 siRNA 寡核苷酸序列,将4对寡核苷酸序列退火成双链后分别插入siRNA 表达载体 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 中构建4个 siRNA 表达质粒,测序鉴定后将4个 siRNA 表达质粒分别转染 HEK293细胞,利用 Western 印迹和 qPCR 方法检测干扰效果;将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒,感染大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),并采用 TNFα干预诱导 UCH-L1表达升高,Western 印迹验证干扰效果.结果:测序分析证实4对 siRNA 寡核苷酸序列分别插入 siRNA 表达载体 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR;qPCR 检测与 Western 印迹均表明第3号 siRNA 表达载体对 UCH-L1表达的抑制程度最高,将其包装成腺病毒并转染 VSMC 能显著抑制 TNFα诱导的UCH-L1表达升高.结论:构建并筛选出干扰效果好的 UCH-L1 siRNA 干扰载体.     

利用小干扰RNA降低新基因CCP22的表达水平

目的:构建针对新基因CCP22的小干扰RNA(siRNA),降低CCP22蛋白表达水平。方法:设计一条针对新基因CCP22的siRNA序列,克隆到siRNA表达载体pSilencer-2.1-U6-neo上,测序验证正确后,将此表达载体与重组Flag-CCP22的表达载体pcDNA3.0-FLAG-CCP22共转染HEK293T细胞系,或单独转染CCP22siRNA,用West-ern印迹检验构建的CCP22siRNA的效果。结果:构建了针对新基因CCP22的siRNA,Western印迹结果表明CCP22siRNA序列能有效降低外源和内源CCP22蛋白的表达水平。结论:构建的CCP22siRNA干扰效果好,为进一步研究CCP22的功能奠定了基础。     

人源跨膜蛋白43(TMEM43)的检测、细胞内定位及体外真核表达

为探究人源跨膜蛋白43(TMEM43)基因含量、定位分布及体外真核表达情况,利用RT-PCR及Western blot方法分别检测内源MRC-5和HEK293细胞内TMEM43基因及其蛋白表达情况,采用间接免疫荧光实验进一步分析其在MRC-5细胞内的分布;构建重组表达载体pcDNA3.1-EGFP-TMEM43,转染至HEK293细胞内检测外源TMEM43在HEK293细胞内的基因和蛋白表达情况。结果显示,基因水平TMEM43在MRC-5细胞内的表达明显高于HEK293细胞,蛋白水平仅能检测到MRC-5细胞内TMEM43的表达。重组表达质粒pcDNA3.1-EGFP-TMEM43转染HEK293细胞后,基因水平TMEM43表达显著升高, Western blot可检测到转染后细胞内TMEM43蛋白成功表达。结果表明,不同细胞表达TMEM43含量存在差异,肺来源细胞内TMEM43的表达明显高于肾来源的细胞;构建的重组载体pcDNA3.1-EGFP-TMEM43可成功转染HEK293细胞并表达。该研究为TMEM43结构及功能、与疾病相关机理的进一步探究提供了实验依据。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

NIPSNAP3A短发夹RNA腺病毒载体的构建及病毒包装

目的:构建靶向NIPSNAP3A的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,干扰HEK293A细胞中NIPSNAP3A的表达。方法:设计靶向NIPSNAP3A的shRNA,插入穿梭质粒pENTRY,通过Gateway法获得腺病毒颗粒pAd-NIPSNAP3A-shRNA,转染HEK293A细胞,在细胞内包装获得腺病毒。结果:重组腺病毒载体经酶切鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制NIPSNP3A蛋白的表达。结论:干扰HEK293A细胞NIPSNAP3A表达的shRNA重组腺病毒载体构建成功。     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。     

人VHL基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制

目的:构建人抑癌基因VHL的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人VHL基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约650 bp的DNA片段,并克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,蛋白免疫印迹检测到相对分子质量为26×103的目的基因表达产物;细胞生长曲线显示,转染myc-VHL的乳腺癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了myc-VHL真核表达载体,myc-VHL抑制癌细胞生长,为进一步研究VHL在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

TRIM25及其缺失突变体真核表达载体的构建及表达

目的:扩增先天性免疫中具有重要功能的泛素连接酶TRIM25及其不同结构域的cDNA,构建带有不同标签的融合蛋白载体并进行细胞表达。方法:以TRIM25 cDNA为模板,PCR扩增不同结构域cDNA,扩增产物及载体经酶切、连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑克隆,提取重组质粒后酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转染293细胞,用Western印迹对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:TRIM25、Two-BOX结构域、SPRY结构域以正确读框插入Flag-pcDNA3.0,TRIM25以正确读框插入pCMV-Myc,RING结构域、CDD结构域、Two-BOX结构域以正确读框插入pEGFP-c1,上述重组质粒能够在293细胞中表达。结论:构建了TRIM25及其突变体的重组表达质粒并获得表达,为研究不同RNA病毒通过与TRIM25作用抑制宿主功能提供了基础。     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。     

利用RNA干扰抑制p21WAF1/CIP1基因的表达及周期阻滞效应

目的：构建p21WAF1/CIP1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,观察其对p21WAF1/CIP1表达的影响和细胞周期的变化。方法：合成了针对p21WAF1/CIP1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,将重组质粒和带FLAG标签的p21WAF1/CIP1共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验RNA干扰（RNAi）敲低外源p21WAF1/CIP1的效果;将重组质粒单独转染293T人胚肾细胞,利用p21WAF1/CIP1抗体检测RNAi敲低内源p21WAF1/CIP1的效果;利用流式细胞仪检测敲低后细胞周期的变化。结果：测序证明构建了p21WAF1/CIP1siRNA真核表达载体;Westernblot和流式细胞分析证明,构建的siRNA能有效降低p21WAF1/CIP1基因的表达,并且使G1期细胞数减少14.03%,S期细胞增多13.45%。结论：构建了p21WAF1/CIP1siRNA的真核表达载体,该siRNA能有效抑制p21WAF1/CIP1基因的表达并部分解除了G1期阻滞。     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

人Polo样激酶1基因的克隆表达及其影响c-Abl表达水平功能的初探

目的:克隆并在293细胞中表达人Polo样激酶1(Plk1)基因,探索Plk1对非受体型酪氨酸激酶c-Abl表达水平的影响。方法:利用PCR法扩增Plk1基因,分别定向克隆至pcDNA3-Flag及pCMV-Myc真核表达载体,将上述质粒分别转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达;将上述质粒分别与c-Abl表达质粒共转293细胞,检测带有不同标签的Flag-Plk1或Myc-Plk1对细胞中c-Abl激酶表达的影响。结果:构建了Flag-Plk1和Myc-Plk1真核表达质粒,其在293细胞中均可表达,蛋白的相对分子质量为68×103;与其共转的c-Abl激酶表达水平显著下调。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1和Myc-Plk1蛋白,且初步发现Plk1可以抑制c-Abl的表达。