日本七鳃鳗L-STAT3的克隆及体内外表达分析

作为信号转导和转录激活子(STAT)蛋白家族的成员之一,信号转导和转录激活因子3(STAT3)在细胞分化、免疫等众多过程都发挥着重要的作用.该研究在克隆获得日本七鳃鳗STAT3全长的基础上,对其氨基酸序列与其他物种来源的STAT3氨基酸序列进行了同源性比对,将日本七鳃鳗STAT3命名为L-STAT3.对L-STAT3基...     

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)VLRB的克隆表达及单克隆抗体制备

七鳃鳗(Lampetra japonica)和盲鳗(Hyperotreti)作为现存的无颌类脊椎动物的代表,其适应性免疫系统中的受体分子与哺乳动物的抗原受体分子不同,这种独特的受体分子称为可变淋巴细胞受体VLRs(Variable lym-phocyte receptors)。目前VLRs分为3类,分别是VLRA、VLRB、VLRC,而VLRB由七鳃鳗类B淋巴细胞产生,是其体液免疫中主要成分,与IgM结构和功能类似。文章对日本七鳃鳗VLRB基因保守的C末端进行克隆、原核表达和重组蛋白纯化后,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合及间接酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immu-nosorbent assay,ELISA)筛选技术得到针对VLRB保守区的单克隆抗体细胞株。将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔得到大量的单抗腹水,经Protein G亲和纯化后的单抗进行ELISA与Western blotting检测。经ELISA检测抗体效价为1:40000。Western blotting结果显示该单克隆抗体能够特异的检测重组VLRB蛋白及七鳃鳗血清中分泌型VLRB。流式细胞实验证明该单抗能特异识别七鳃鳗类淋巴细胞表面表达的膜型VLRB。VLRB单克隆抗体的成功制备和建株,为研究日本七鳃鳗基于VLR的适应性免疫系统提供了重要的工具。     

七鳃鳗血清中补体C3和VLRB介导的免疫防御

日本七鳃鳗（Lampetra japonica）属最原始的无颌类脊椎动物,是研究免疫起源与进化的重要模式生物。七鳃鳗血清中C3分子(L-C3)是其含量最高的补体成分,在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。本文通过PCR扩增获取C3分子α-γ链的基因序列,构建到原核表达载体pET-28a,成功在大肠杆菌中表达C3部分蛋白质并制备多克隆抗体。利用流式细胞术和激光共聚焦证明,L-C3分布在神经轴体的胞浆中。免疫共沉淀及细胞沉积结果显示,七鳃鳗血清中,VLRB与L-C3蛋白相互作用并共沉积于靶细胞膜表面。天然L-C3和VLRB清除实验,验证其在参与七鳃鳗血清杀伤靶细胞时发挥重要作用。本研究为七鳃鳗补体系统的研究奠定了基础,为七鳃鳗免疫起源与进化提供重要资料。     

日本七鳃鳗物种特异性microRNAs及其前体的识别与验证

MicroRNAs(miRNAs)对参与多种生物代谢过程的基因在转录及转录后水平进行负调控。近年来,随着深度测序及芯片技术的应用,有关miRNA的发现和功能分析在植物和动物中得到广泛研究。文章利用第二代测序技术对日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞的小RNA进行了高通量测序,共得到5 207 787条小RNA序列,其中4 739 346条序列可以拼接为10 989种mi RNA变体。基于序列相似性分析,发现这10 989个变体序列与306个已知的保守mi RNA家族成员序列相匹配;其中,6个保守miRNA家族成员呈极高丰度表达,表明mi RNA在物种间具有保守性。70个未注释序列被预测为新的miRNA。通过miRNA微阵列技术鉴定与验证了34个新预测的mi RNA在免疫处理的日本七鳃鳗白细胞中表达,其中16个mi RNA前体的最低折叠自由能系数大于0.85,说明日本七鳃鳗存在特异性miRNA。这些物种特异性miRNAs的存在可能在日本七鳃鳗的白细胞生长、发育和对疾病的反应中发挥重要的调控作用。     

日本七鳃鳗RGD毒素肽Lj-RGD2的克隆、表达及其抗血管新生活性

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD2毒素肽分子质量为8 kD,是含有2个RGD（Arg-Gly-Asp）模体序列的多肽.为了探讨其是否具有RGD毒素蛋白的功能,对其基因进行了克隆和表达,并对其重组蛋白进行了抗血管新生活性研究.从日本七鳃鳗口腔腺中提取mRNA,以自行设计的引物进行RT-PCR扩增,以获得Lj-RGD2基因;将获取的目的基因与pET23b载体连接,经转化、克隆、阳性转化子的筛选鉴定;将含组氨酸标签的pET23b-Lj-RGD2转化BL21菌中诱导表达;经亲和层析纯化,获得可溶性重组rLj-RGD2蛋白,并对重组rLj-RGD2蛋白的抗血管新生功能进行了研究.结果显示,rLj-RGD2蛋白的IC50为1.77μmol/L,并以剂量依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖;rLj-RGD2蛋白还能抑制ECV304细胞对人工基质膜Matrigel的黏附、以BFGF（basic fibroblast growth factor）为趋化剂的迁移及侵袭.鸡胚绒毛尿囊膜CAM（chick chorioallantoic membrane）血管新生实验结果表明,rLj-RGD2蛋白能以剂量依赖方式抑制BFGF诱导的CAM血管新生.由此可见,rLj RGD2蛋白具有RGD毒素肽的活性特征,其有望成为一种抗血管新生基因工程新药. 关键词日本七鳃鳗; RGD毒素蛋白; 细胞黏附; 迁移及侵袭; 血管新生     

日本七鳃鳗钙调蛋白分子克隆、组织定位及功能分析

钙调蛋白（calmodulin,CaM）是高度保守的钙离子结合蛋白质,可形成Ca ²⁺-CaM复合体,从而调节细胞代谢以及靶酶的功能。日本七鳃鳗（Lampetra japonica）作为原始的无颌类脊椎动物,对研究脊椎动物分子起源进化及器官发育分化具有重要的研究价值。通过提取日本七鳃鳗髓组织总RNA,利用RT-PCR方法获得日本七鳃鳗CaM（简称Lj-CaM）基因并进行生物信息学分析。将Lj-CaM基因分别构建到原核表达载体pColdⅠ和真核表达载体pEGFP-N1中,利用亲和层析技术纯化得到Lj-CaM蛋白。圆二色谱分析结果表明,Lj-CaM属于典型的α-螺旋结构型蛋白质。免疫印迹和免疫组化结果表明,CaM主要存在于日本七鳃鳗的肠、鳃、髓、肾组织中,在心和肝组织中几乎不表达。细胞免疫荧光结果显示,CaM定位于细胞核中。qPCR和免疫印迹方法检测发现,当293T细胞中Lj-CaM过表达时,对下游靶基因CaMKⅡ作用不明显,但促进PLA2G2A表达。本研究报道了日本七鳃鳗CaM结构、细胞组织定位分布以及基因调控研究,对其结构、分子起源与进化、分子调控及功能方面的研究奠定了基础。     

七鳃鳗Lja-SHP2分子鉴定、重组表达及免疫学研究

高等脊椎动物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因编码,催化酪氨酸残基去磷酸化,与其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同调节机体内多种信号通路的信号传导。以往研究表明,SHP2在高等脊椎动物T细胞和B细胞的激活与信号转导过程中起着重要作用。为了研究无颌类脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中与SHP2同源的分子——Lja-SHP2在免疫应答反应中的作用,本研究通过PCR扩增获取其Lja-SHP2开放阅读框序列,并构建到原核表达载体pET-32a中,成功在大肠杆菌中实现重组蛋白表达并制备了其兔源多克隆抗体。用混合菌免疫刺激日本七鳃鳗后,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测了Lja-SHP2在日本七鳃鳗免疫相关组织中mRNA和蛋白水平表达谱。结果显示,混合菌免疫刺激后,Lja-SHP2 mRNA和蛋白表达在外周血白细胞和髓样小体中无显著变化,而在鳃组织中显著性上调(P<0.05),说明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要参与了鳃组织的免疫应答反应。为了进一步探究Lja-SHP2与淋巴细胞亚群免疫应答反应的相关性,本研究分别使用B细胞有丝分裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和T细胞的有丝分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)免疫刺激日本七鳃鳗。经LPS免疫刺激后,与对照组相比,白细胞中Lja-SHP2蛋白表达显著上调,鳃组织和髓样小体没有显著性差异表达;但经PHA免疫刺激后,与对照组相比,白细胞、鳃组织和髓样小体3种组织中Lja-SHP2均有上调,尤其在白细胞中上调最为显著,大约是对照组的2.5倍,说明Lja-SHP2参与了日本七鳃鳗由PHA介导的免疫应答反应。由于PHA能刺激日本七鳃鳗鳃组织中VLRA+淋巴细胞的活化,这表明Lja-SHP2可能参与了PHA介导的VLRA+淋巴细胞亚群的免疫应答反应。上述研究结果为进一步探索Lja-SHP2在七鳃鳗免疫应答过程中的功能奠定了基础,也为揭示SHP2分子家族的系统发生及探索高等脊椎动物适应性免疫系统的早期发生及其进化历程提供一定的线索。     

日本七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能

Lj-RGD1来源于日本七鳃鳗口腔腺,富含半胱氨酸并具有RGD(Arg-Gly-Asp)模体.为了验证Lj-RGD1是否具有抑制血小板聚集、抗血管新生等去整合素样典型功能,本文对七鳃鳗Lj-RGD1进行了克隆表达及活性测定.提取七鳃鳗口腔腺中总RNA进行RT-PCR扩增,获得Lj-RGD1的420 bp cDNA.对其进行克隆、表达及组氨酸亲和层析纯化后,获得分子量为169 kD的可溶性蛋白rLj-RGD1.活性测定结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的兔血小板聚集,IC50为123 μmol/L;血管新生抑制实验结果表明,rLj-RGD1能够诱导ECV304细胞凋亡,抑制ECV304细胞增殖和管状物形成,并呈剂量依赖性方式抑制鸡胚胎绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）血管新生.由此可见,Lj-RGD1具有去整合素样生物活性,在血栓或血管异常新生类疾病治疗中具有应用前景.     

糖皮质激素诱导淋巴细胞凋亡的细胞学机制

糖皮质激素在多年前就已被证实能够诱导淋巴细胞的凋亡,因而被作为有效的免疫抑制剂。由于这一过程的复杂性,以及相对于其他诱导因素的特异性,至今为止尚未能清楚地了解其整个过程,但对其诱导机制的认识有了长足的进展,目前认为这一过程基本上可以分为三个阶段,即启动阶段、决定阶段以及执行阶段。现将近年来对糖皮质激素在诱导细胞凋亡的机制方面的研究进展作一综述。     

日本七鳃鳗钙调蛋白分子克隆、组织定位及功能分析北大核心CSCD

钙调蛋白(calmodulin,CaM)是高度保守的钙离子结合蛋白质,可形成Ca2+-CaM复合体,从而调节细胞代谢以及靶酶的功能。日本七鳃鳗(Lampetra japonica)作为原始的无颌类脊椎动物,对研究脊椎动物分子起源进化及器官发育分化具有重要的研究价值。通过提取日本七鳃鳗髓组织总RNA,利用RT-PCR方法获得日本七鳃鳗CaM(简称Lj-CaM)基因并进行生物信息学分析。将LjCaM基因分别构建到原核表达载体p ColdⅠ和真核表达载体p EGFP-N1中,利用亲和层析技术纯化得到Lj-CaM蛋白。圆二色谱分析结果表明,Lj-CaM属于典型的α-螺旋结构型蛋白质。免疫印迹和免疫组化结果表明,CaM主要存在于日本七鳃鳗的肠、鳃、髓、肾组织中,在心和肝组织中几乎不表达。细胞免疫荧光结果显示,CaM定位于细胞核中。q PCR和免疫印迹方法检测发现,当293T细胞中Lj-CaM过表达时,对下游靶基因CaMKⅡ作用不明显,但促进PLA2G2A表达。本研究报道了日本七鳃鳗CaM结构、细胞组织定位分布以及基因调控研究,对其结构、分子起源与进化、分子调控及功能方面的研究奠定了基础。     

Cellular Reprogramming of Human Peripheral Blood Cells

Breakthroughs in cell fate conversion have made it possible to generate large quantities of patient-specific cells for regenerative medicine. Due to multiple advantages of peripheral blood cells over fibroblasts from skin biopsy, the use of blood mononuclear cells （MNCs） instead of skin fibroblasts will expedite reprogramming research and broaden the application of reprogramming technology. This review discusses current progress and challenges of generating induced pluripotent stem cells （iPSCs） from peripheral blood MNCs and of in vitro and in vivo conversion of blood cells into cells of therapeutic value, such as mesenchymal stem cells, neural cells and hepatocytes. An optimized design of lentiviral vectors is necessary to achieve high reprogramming efficiency of peripheral blood cells. More recently, non-integrating vectors such as Sendai virus and episomal vectors have been successfully employed in generating integration-free iPSCs and somatic stem cells.     

七鳃鳗p38α和β参与LPS介导的VLRB类淋巴细胞亚群的免疫应答反应

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases,MAPK）家族的一个亚类,在高等脊椎动物免疫应答的信号转导过程中扮演着非常重要的角色。在日本七鳃鳗（Lampetra japonica）中发现,p38MAPK以两种异构体的形式存在。通过克隆它们的开放阅读框并进行同源序列比对和系统发育分析,鉴定它们分别为p38α（Lja-mapk14）和p38β（Lja-mapk11）。用混合菌刺激七鳃鳗,利用免疫印迹方法,检测Lja-mapk14在外周血类淋巴细胞、鳃组织和髓样小体中,分别在加强免疫36 h、24 h和24 h后,表达量达到峰值,分别为对照组的2.9、2.1和2.6倍;而Lja-mapk11在以上组织中,都在加强免疫36 h后达到表达量峰值,分别为对照组的2.2、2.5和6.3倍。实时荧光定量PCR检测发现,Lja-mapk14的mRNA表达水平在混合菌加强免疫36 h后,分别在类淋巴细胞、鳃组织和髓样小体中,上调2.3、1.5和3.4倍;而Lja-mapk11的则分别在类淋巴细胞、鳃组织和心肌中,上调1.3、2.6和1.6倍。以上结果在mRNA和蛋白质水平证明,Lja-mapk14和Lja-mapk11均参与七鳃鳗的免疫应答反应。采用B细胞和T细胞丝裂原LPS和PHA分别对七鳃鳗进行刺激,免疫印迹结果显示,Lja-mapk14和Lja-mapk11蛋白质表达量经LPS加强免疫36 h后,在类淋巴细胞、鳃组织和髓样小体中,上调表达1.3 ～ 4.1倍;而经PHA加强免疫36 h后,Lja-mapk14和Lja-mapk11在上述组织中表达量均不存在显著变化。以上结果说明,Lja-mapk14和Lja-mapk11可能参与了B细胞丝裂原LPS介导的VLRB类淋巴细胞亚群的免疫应答反应。     

Fumonisin and Beauvericin Induce Apoptosis in Turkey Peripheral Blood Lymphocytes

Fumonisins, a family of mycotoxins produced by Fusarium verticillioides (synonym Fusarium moniliforme Sheldon) and F. proliferatum, have been associated with various deleterious effects in different animal species. Serological, hematological and pathological effects and mortality have previously been observed in broiler chicks fed F. proliferatum culture material containing known concentrations of fumonisin, moniliformin and beauvericin. Turkey peripheral blood lymphocytes were exposed in vitro for 72 hours to fumonisin B₁(FB₁), fumonisin B₂(FB₂), hydrolyzed fumonisin B₁ (HFB₁), moniliformin and tricarballylic acid (TCA) (0.01-25 g/ml). A decrease in cell proliferation, as determined by the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] bioassay, occurred in the order: FB₂ > FB₁ > HFB₁, with IC₅₀ = 0.6 M, 1 M and 10 M, respectively. Internucleosomal DNA fragmentation and morphological features characteristic of apoptosis were observed following exposure to fumonisin B₁ and beauvericin; cytoplasmic condensation and membrane blebbing were seen by light microscopy. Tricarballylic acid and moniliformin did not interfere with cell proliferation. Results suggested that fumonisin B₁ and beauvericin may affect immune functions by suppressing proliferation and inducing apoptosis of lymphocytes.     

Uptake of L-leucine by Trout Red Blood Cells and Peripheral Lymphocytes

The uptake of l-leucine by trout red blood cells and peripheral lymphocytes has been analyzed. The present study shows two functionally different Na⁺-independent systems for apolar branched-chain amino acids. They are designated as L systems because they share some properties with the mammalian L system. The carrier present in red blood cells has low K _m values, is trans-stimulable and not stereospecific for leucine uptake; on the other hand, the system present in lymphocytes is stereospecific for leucine uptake and trans-inhibitable. Both carriers are pH sensitive in a similar fashion at low pHs, but there are important differences at higher pH values (above neutrality). These properties are compared with these of the asc systems previously reported in these cells. Received: 2 June 1995/Revised: 7 March 1996     

脾切断流术围术期患者外周血淋巴细胞的变化及免疫功能的研究

目的:本实验旨在探讨脾切除门奇静脉断流术后患者外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞的变化,评估患者的抗肿瘤免疫能力是否有所影响,及机体的免疫系统有何变化.方法:选择择期行脾切除门奇静脉断流术的肝硬化患者20名,给予全凭静脉麻醉.分别于麻醉前(T0)、切皮前(T1)、脾切除即刻(T2)、脾切除后1h(T3)、手术完毕(T4)、手术后1d(T5)、手术后7d(T6)时抽取病人外周静脉血2mL,采用流式细胞仪测定CD3+、CD4+、CD8+、CD19+B细胞、CD3-56+(NK细胞)绝对数量.结果:与麻醉前相比,切皮前CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞、NK细胞均明显的降低,而在脾脏切除即刻各系细胞又明显恢复,基本与麻醉前水平相当.然而随着手术继续,在脾脏切除后1h,仅B细胞低于术前,一直持续到手术完毕,但是,此时B细胞与麻醉前比已没有统计学差异.手术完毕时T、B细胞和NK细胞再次降低,但仍明显高于切皮前水平.手术后1d时,CD4+T细胞与NK细胞仍然低于麻醉前,CD3T细胞、CD3+CD8+T细胞和B细胞已经恢复到麻醉前水平.术后7d时,CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞及B细胞不仅得到恢复,而且还比麻醉前明显升高,但是NK细胞仍与麻醉前的水平相当.结论:异丙酚联合瑞芬太尼麻醉对门脉高压患者行脾切除门奇静脉断流术患者的T、B淋巴细胞和NK细胞有快速、短期的降低作用,术后7d人体淋巴细胞数量不仅得到恢复,并且反馈性地升高,提示脾脏切除手术能够有效提升患者的免疫细胞数量.     

X射线对人外周血淋巴细胞DNA损伤修复和凋亡的影响

目的 研究不同时间诱导X射线照射的淋巴细胞进入细胞周期DNA损伤修复与凋亡的影响.方法 X射线（0.5 Gy）作用于正常人外周血淋巴细胞,以照射后不同时间点（0、4 h）分别加入PHA并分成两组,即照射后0 h加PHA组（A组）和照射后4 h加PHA组（B组）,再分别培养0、0.5、2 h,用流式细胞术和免疫印迹法检测A组和B组γ-H2AX蛋白的表达,Annexin-V/PI法分析A、B两组的细胞凋亡率.结果 流式细胞术及免疫印迹结果均显示A组的γ-H2AX蛋白表达高于B组（P＜0.05）,且均先升高后降低.A组细胞凋亡率亦大于B组.结论 不同时间诱导被打击的淋巴细胞进入周期其可能发生DNA修复并同时伴随细胞凋亡的发生.     

人类外周血淋巴细胞中“自发”和诱发的SCE频数分布的比较

“自发”SCE频数在细胞间的分布,服从Poisson分布;而以CSC诱发的SCE频数则服从正态颁。分布类型的改变,可能是由于平均数的增加所致。平均数的增加,以A组和C组染色体为甚。     

利用猪血清短期培养人体外周血淋巴细胞的研究

用猪血清代替小牛血清作人体外周血淋巴细胞短期培养,进行染色体分析及淋巴细胞转化的研究。在94例姐妹染色单体差别染色的培养中,培养液分别加入小牛血清与猎血清,细胞有丝分裂指数分别为3.91％和3.78％;21例常规法培养中,分裂指数分别为9.10％和9.21％;5例淋巴细胞转化试验,小牛血清和猪血清培养的转化率分别为69.52％和69.59％;16例阉割后公、母猪血清加入培养基中,细胞分裂指数(SCD法)分别为2.96％和3.14％。以上各项对照试验,均无显著性差异(P>0.05)本研究证实,猪血清可用于人体外周血淋巴细胞短期培养。     

Variation in Chromatin Structure of the rDNA Transcribed Region in Human Peripheral Blood Lymphocytes

The rDNA transcribed region (TR) was tested for its accessibility for RsaI recognizing 15 TR sites, DNase I, and photoinducible arylazide (N-(4-azido-2-hydroxybenzoyl)-N,N"-diaminoheptane acetate) in isolated nuclei, and for the arylazide in intact cells. Arylazide readily entered the cells and did not appreciably affect the chromatin structure. Its photolysis products efficiently modified DNA in accessible sites. Single-strand breaks made by DNase I were not transformed into two-strand ones in rDNA TR, suggesting the necessity of denaturing electrophoresis for such an analysis. About 70% of all rDNA copies proved poorly accessible for endonucleases and arylazide, the accessibility being higher in their 18S and 5.8S rRNA gene regions than in the regions of the external transcribed spacers (ETSs) and the 28S rRNA gene. Proteinase K disrupted this structure, and the corresponding copies were extracted from nuclei. This explained whyin situ hybridization occasionally fails to reveal rDNA in the nucleolar fibrillar center (FC) on electron microscopic preparations. In other rDNA copies, TR (excluding 5"-ETS) was accessible for nucleases and arylazide. These copies were not extracted from nuclei treated with proteinase K. Some of their RsaI sites were protected by tightly bound proteins. Seven such regions were identified in TR. Possible association of the molecular structure, nucleolar location, and functional state of rDNA is discussed.