柞蚕抗菌肽D中精氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸残基的化学修饰

用不同的化学试剂修饰了柞蚕抗菌肽D分子中的色氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基。NBS修饰抗菌肽D,以及氨肽酶M对抗菌肽D作用的结果表明色氨酸残基对抗菌肽D抑制E.coli D31的作用影响不大。CHD和MLH对精氨酸和赖氨酸残基的修饰,导致抗菌肽D失去抑制E.coli的作用,但可逆地消除CHD和MLH的修饰作用后,抗菌肽D恢复了对E.coli D31的抑菌作用。这些结果初步认为,抗菌肽D抑菌作用与分子中的荷电性有关,改变了分子的电荷,也就同时失去了其抑菌功能。 此外,对精氨酸残基修饰的结果还表明,抗菌肽D的免疫原性与精氨酸残基有关。但是,抗菌肽D的免疫决定簇与其生物活性中心并不完全平行。     

中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆及抗菌、抗癌和溶血活性的测定

采用RT-PCR和3￠RACE方法, 从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同抗菌肽前体的cDNA序列, 分别命名为: preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。cDNA碱基序列全长为289~315 bp, 编码59~65个氨基酸。6个抗菌肽前体由3部分结构域组成: 22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体, 具有肽链短, C-端酰胺化的特点; preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体, 在肽链的C-端含有RANA盒结构, 可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键, 组成7肽环; preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽, 被鉴定为新抗菌肽。人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四种中国林蛙皮肤抗菌肽, 活性检测结果表明: 它们对金黄葡萄球菌等3种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用, 同时抑制乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞生长。     

穴居狼蛛毒中一个抗菌活性多肽的鉴定和纯化

从我国新疆地区产穴居狼蛛的毒液中分离纯化了一种多肽——狼蛛抗菌肽(Lycosin)。穴居狼蛛的粗毒在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分出11条蛋白带,用0.6％的大肠杆菌琼脂胶覆盖在凝胶上进行鉴定表明,电泳迁移率最快的区带有抗菌活性。经鉴定该多肽分子系由43至45个氨基酸残基组成,N-末端为丙氨酸,分子中的碱性和疏水性氨基酸分别占总氨基酸残基数的1/4和1/3。     

铰链结构对抗菌肽生物活性的影响及在分子设计中的应用研究进展

铰链结构,又称铰链区或转角,是部分抗菌肽序列中存在的一种特殊结构。但目前抗菌肽结构的研究多集中于标准的α-螺旋和β-折叠二级结构,对于铰链结构及其作用总结较少。铰链结构对抗菌肽生物活性有重要影响,主要原因是铰链结构能够提高抗菌肽的结构灵活性,促进其对细菌细胞膜的破坏作用或与胞内作用靶点的结合效率,进而提高抗菌肽的抗菌活性。同时,降低的抗菌肽结构刚性,消减了抗菌肽对真核细胞的毒性。文中结合了笔者课题组相关工作,就铰链结构特点、对抗菌肽生物活性的影响以及在抗菌肽分子设计方面的应用进行了综述,以期为新型抗菌肽的设计和开发提供参考。     

景东湍蛙抗菌肽jindongenin-1d的分析和活性测定

新型抗菌肽研究有助于解决细菌对抗生素的耐药性问题。本研究用SMART技术构建了景东湍蛙Amolops jingdongensis皮肤的全长cDNA文库。通过单克隆和测序获得一个抗菌肽cDNA序列,序列比对结果表明其属于jindongenin-1家族,命名为jindongenin-1d。其cDNA序列全长321bp,编码含66个氨基酸残基的多肽。该多肽包括1个信号肽和1个前肽序列。成熟jindongenin-1d多肽包含24个氨基酸残基,理论分子量为2 709.38,等电点为9.24。对人工合成的jindongenin-1d蛋白进行了抗菌和溶血活性分析,结果表明jindongenin-1d对所选的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均有显著抑制作用,同时有弱溶血活性。本研究结果有助于进一步了解两栖动物皮肤分泌物活性物质的多态性和新型抗感染药物的设计。     

东北林蛙皮肤中一类新抗菌肽cDNA的克隆及成熟肽的预测

为进一步研究和开发高效广谱天然抗生素的抗菌肽,本文克隆东北林蛙(Rana dybowskii)的抗菌肽基因,并预测其成熟肽的有关性质。根据蛙属抗菌肽信号肽末端序列设计简并引物,以RT-PCR技术扩增皮肤中抗菌肽的cDNA,并进行克隆测序。用生物信息学软件分析cDNA序列特点,预测成熟肽的理化性质。研究发现一种长度为28个氨基酸残基的新抗菌肽dybowsin-1,该肽具有Rana box结构;与已发现的抗菌肽仅有35%的同源性;理论等电点在9.70-10.01之间;均呈阳离子性;从第3或4个氨基酸开始到第16个氨基酸形成α-螺旋结构,极性氨基酸位于螺旋轮的一侧,非极性氨基酸位于螺旋轮的另一侧;具有N-端疏水、C-端亲水的两亲性。一个个体表达5条cDNA序列编码3种不同的dybowsin-1分子,显示出该抗菌肽表达的多样性。序列分析显示,该抗菌肽可能由多基因座位编码。     

Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA mil杂合肽基因全长分别为 1 0 1bp和 60bp ,并在其N端引入kex2裂解位点 ,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中 ,cecA mil杂合肽基因根据cecropinAN端第 1～ 7个氨基酸残基、melittinN端第 5～ 1 2个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα A质粒 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα A mag和pPICZα A CM。在AOX1 (醇氧化酶 )启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA mil蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 1 0 5mg L和 1 1 8mg L。初步抑菌活性测定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coliDH5α有较好的抑杀活性。     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶cDNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有工业价值的碱性脂肪酶 (PEL) .在测定了其N端 12个氨基酸残基序列的基础上 ,通过RT PCR、5′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得了PEL完整的cDNA序列 (GenBank登录号为AF2 84 0 6 4 ) .cDNA全长 10 5 0bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区cDNA由 85 5个碱基组成 ,编码 1个由 2 85个氨基酸残基组成的酶蛋白 ,其信号肽及前肽部分由 2 7个氨基酸残基组成 ,成熟肽部分由 2 5 8个氨基酸残基组成 .根据氨基酸组成推导该脂肪酶蛋白的分子量为 2 7 3kD .该脂肪酶的氨基酸序列 130～ 134位上有各类脂肪酶中普遍存在的G X S X G保守序列     

簇毛麦HMW-GS及其启动子基因的克隆与序列分析

利用2对特异引物,从簇毛麦(Dasypyrum villosum)基因组中分离克隆出一个簇毛麦HMW-GS基因VHG-2(GenBank登录号为FJ600492)及其启动子序列VHGp-1(GenBank登录号为FJ600489).VHGp-1序列长度为1 099 bp,从5′至3′方向依次有E-box、N-box、G-box、HMW谷蛋白特异38 bp增强子和TATA-box等典型的HMW-GS基因启动子作用调控元件,说明VHGp-1为簇毛麦HMW-GS的启动子基因.VHG-2序列长度为1 572 bp,具有单一完整的、可编码498个氨基酸的开放阅读框(ORF),该ORF推导的氨基酸序列结构分析表明,编码区依次包含由21个氨基酸残基组成的信号肽、105个氨基酸残基组成的N-末端区、330个氨基酸残基组成的中部重复区和42个氨基酸残基组成的C-末端区;中部重复区主要重复单元为6肽(PQQGQQ)和9肽(GYYPTSP/LQQ);有6个半胱氨酸残基(Cys),其中5个分布在N-末端区,1个分布在C-末端区,第3、4个相邻.这些特征与报道的y-型HMW-GS多肽结构基本一致,说明VHG-2是簇毛麦的y-型HMW-GS基因.系统进化分析表明,簇毛麦HMW-GS启动子序列(VHGP-1)与智利大麦(H.chilense)H基因组的D-hordein基因、拟鹅观草和阿拉善鹅观草St基因组的HMW-GS基因的启动子具有比较近的同源关系,簇毛麦HMW-GS基因(VHG-2)与冰草、拟鹅观草和中间偃麦草的y-型HMW-GS基因具有较近的同源关系.     

九香虫抗菌肽CcAMP1的分离纯化和抗菌活性检测

【目的】从药用昆虫九香虫 Coridius chinensis 中分离纯化抗菌肽,为进一步开发九香虫抗菌肽资源及深入挖掘九香虫的药用功能奠定基础。【方法】用大肠杆菌Escherichia coli 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 混合物作诱导源刺激九香虫产生抗菌肽,对血淋巴进行提取、凝胶过滤层析、固相萃取及反相色谱纯化,活性组分经质谱测定。对分离得到的这种抗菌肽进行人工合成,并进行抗菌活性检测。【结果】本研究获得一种九香虫抗菌肽CcAMP1,由17个氨基酸残基组成,分子量为1 997.37 u,带1个正电荷,表面有5个疏水氨基酸。对人工合成的CcAMP1进行抗菌活性检测表明,该抗菌肽与九香虫血淋巴一样对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌都有较好的抗菌活性,且对革兰氏阴性菌的抗菌活性更强。【结论】从九香虫中分离得到具有较强抗菌活性的阳离子抗菌肽CcAMP1,有较大的开发利用价值。