基因枪法获得GAI转基因橡胶植株的研究

将含有Camv35S启动子、卡那霉素抗性基因和GUS报告基因,目的基因为GAI基因的转化载体质粒pBI121,通过基因枪轰击巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg.)花药愈伤组织,50 mg L~(-1)卡那霉素的继代培养基进行抗性筛选.获得了抗性再生植株,经过PCR、Southern检测结果表明:GAI基因已经成功转入橡胶树基因组中.     

基因枪法将GAI基因导入巴西橡胶的研究

为了探讨利用基因工程技术进行橡胶树品质改良的可行性,用基因枪轰击巴西橡胶(Hevea brasiliensis)愈伤组织,将GAI矮化基因导入橡胶受体中,通过50mg L-1卡那霉素筛选鉴定,优化了基因枪法转化橡胶的各种参数。结果表明,DNA金弹与靶细胞的距离为9cm,每皿轰击一次时,胚状体诱导率可以达到1.87%。经过GUS组织染色和PCR扩增鉴定,初步确定GAI基因已经整合到橡胶基因组中。     

用天花粉蛋白基因转化小麦获得转基因植株

取普通小麦品种京411未成熟胚诱导愈伤组织,10天左右,对820个胚性愈伤组织用含有35S启动子的天花粉蛋白（trichosanthin,TCS)基因轰击。2周后,将这些被轰击的愈伤组织转到含潮霉素50mg/L的筛选培养基上,经分化和生根,获得了33棵再生植株,经接饲毒蚜虫抗病性鉴定和PCR,Southern杂交分析,从中筛选出4株含有编码TCS的转基因小麦植株,转化频率为0．49％。     

通过基因枪轰击转化获得转基因小麦植株的研究

利用ＪＱ－７００型高速基因枪将ｐＤＭ３０２质粒ＤＮＡ上的ｂａｒ基因即ＰＡＴ酶基因导入了冬小麦品种“农大１４６”的幼胚中。经过在含有的选择培养基上筛选,得到了９块具有ｐｐｔ抗性的愈伤组织。ＰＣＲ电泳检测与ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ发要交结果显示,外源ｂａｒ基因已转化进了由其中４块愈伤组织再生出的转基因的小麦植株中。     

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究

以小麦品种H6756和藁城8901作为基因枪转化的靶材料,取其护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗,用含逆境诱导转录因子DREB1A和bar基因的质粒pAHC25轰击胚性愈伤组织,在分别含有5mgL和10mgLBasta溶液的培养基上进行筛选。得到的抗性愈伤组织在不含Basta溶液的培养基上再生培养,获得218棵再生植株。田间涂抹浓度为100mgL的Basta溶液检测后,对抗性植株作PCR检测,获得54棵再生植株。通过对其中20株T1代的PCR和Southern杂交分析,已获得14株含DREB1A和bar基因的转基因小麦植株,其中H675613株,藁城89011株。     

用天花粉蛋白基因转化小麦获得转基因植株

取普通小麦品种京411未成熟胚诱导愈伤组织,10天左右,对820个胚性愈伤组织用含有35S启动子的天花粉蛋白（trichosanthin,TCS）基因轰击。2周后,将这些被轰击的愈伤组织转到含潮霉素50mg/L的筛选培养基上,经分化和生根,获得了33棵再生植株,经接饲毒蚜虫抗病性鉴定和PCR、Southern杂交分析,从中筛选出4株含有编码TCS的转基因小麦植株。转化频率为0.49%。 Abstract：Wheat immature embryo calli of 10 days culture from Jing 411,a common wheat variety, Triticum aestivum, were used as the receptor of Trichosanthin gene droven by 35S promotor to be bombardmented.Two weeks after bombardment, 820 embryonic calli were transferred onto selection medium containing 50mg/L hygromycin,and 33 plantlets with healthy roots were regenerated finaly from the calli. By the barley yellow dwarf virus resistance test of inoculating the wheat aphids carrying the virus on the plants, PCR analysis, and Southern blotting analysis, 4 plants were identified to be the transgenic wheats, containing the alien DNA that ecodes TCS gene. The transformed efficiency was around 0.12 percent.     

基因枪法获得转cry1Ac基因甘蔗的研究

根据定向克隆原则,以pGreenⅡ0229为载体骨架,cry1Ac为目的基因,bar为筛选标记基因,构建了大小为8602 bp的植物表达载体pUBCG0229-cry1Ac。酶切结果表明,构建的载体pUBCG0229-cry1Ac结构完全正确。用基因枪轰击法将pUBCG0229-cry1Ac质粒DNA转化甘蔗(Saccharum Complex)品种福农95-1702和桂糖94-119的胚性愈伤组织,使用PPT(phosphinothricin)对轰击后的材料进行继代、分化和生根筛选,移栽成活后使用Basta溶液喷洒进行初步筛选,共获得86株抗性植株,通过PCR检测、Dot-Southern检测及PCR产物测序,证明已将cry1Ac基因整合到其中22株甘蔗基因组中。     

高赖氨酸蛋白基因导入水稻及可育转基因植株的获得

构建了一个植物高效表达质粒,使来源于四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus(L.)DC)的高赖氨酸蛋白基因（lys）受控于单子叶植物ubiqutin强启动子下表达。用基因枪法将其导入水稻(Oryza sativa L.)幼胚诱导的愈伤组织,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。经PCR和Southem blotting检测,表明该基因已整合到水稻的基因组织。GUS组织化学染色表明转基因水稻植株的叶、茎和根中均有gus基因的表达。测定112株转基因水稻叶片中赖氨酸叶量,大部分植株有不同程度的提高,最高幅度为16．04％。     

几种玉米基因转移技术的研究及转基因植株的获得

用基因枪、超声波和子房注射法转化玉米,所用质粒pB48．415带有3’端截短的Bt毒蛋白基因和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因。用基因枪轰击玉米胚性愈伤组织和幼胚,超声波处理玉米胚性愈伤组织,用自制的微玻针注射授粉后l0～20h的玉米子房,均已成功地获得了转Bt基因的玉米檀株．点杂交和Southern吸印杂交的结果都证明在转基因玉米檀株中存在Bt毒蛋白基因。     

基因枪法转化小麦的金粉用量及转基因植株表型特征分析

研究了不同金粉用量对小麦幼胚瞬间及稳定转化频率的影响,结果表明此实验系统的金粉用量以每枪500μg金粉为佳。对获得的T     

巴西橡胶树转基因研究现状与展望

由于存在遗传背景狭窄、高度杂合化、育种周期长等特点,巴西橡胶树育种进展非常缓慢。转基因技术为拓展其的遗传范围、加速育种进程提供了契机。在过去20年里,橡胶树转基因研究取得了很大进展：成功应用的转化技术包括基因枪法和农杆菌介导法,受体材料包括花药和内珠被愈伤,育种目标涉及到提高胶乳产量、抗死皮和作为生物反应器等。但同时也存在组培程序不够成熟、转化技术和外植体比较单一、转化效率低下等问题。最后,对以后转化体系的优化、转基因育种方向进行了分析和展望。     

基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。     

基因枪法转化水稻E32后代非目标农艺性状变异的研究

采用基因枪法将4个抗真菌性病害基因(RAC22、RCH10、β-1,3-Glu和B-Rip)导入超级稻(Oryza sativa L.)恢复系E32中,经选择获得10个T4代转基因株系。分蘖盛期纹枯病抗性鉴定表明外源基因已在转基因株系中得到表达并获得抗性,这些转基因株系除了产生抗病性等目标性状的变异外,还发生生育期、植株形态、谷粒外观及产量性状等非目标农艺性状变异。对这些非目标性状进行遗传增益和稳定性分析表明,不同转化株系间或性状间的遗传增益均存在较大差异,其中遗传增益最高的性状是单株穗数、着粒密度和单株产量;各性状中以株高、穗长和谷粒外观性状的变异程度最低,单株穗数和千粒重的变异系数最大。通过选择可获得产量与品质性状均有提高的转基因水稻。     

不同提取液对巴西橡胶树橡胶粒子蛋白质提取和分离的影响

橡胶粒子是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）乳管细胞内进行橡胶生物合成的亚细胞结构;对橡胶粒子的蛋白质组学研究,可为揭示天然橡胶生物合成机理提供线索。采用5种提取液分别提取橡胶粒子蛋白,并对橡胶粒子蛋白进行SDS—PAGE和16-BAC／SDS—PAGE电泳分离及MALDITOF／TOF串联质谱分析,证明不同提取液抽提的橡胶粒子蛋白具有不同组成,发现分子量较高的橡胶延伸因子家族蛋白更难从橡胶粒子上被洗脱和提取。通过检索橡胶树转录组数据库,鉴定了3个新的橡胶粒子蛋白,即醌氧化还原酶、含蓖麻毒素B链凝集素结构域蛋白及枯萎／脱水相关蛋白。本研究建立的橡胶粒子蛋白质提取和分离方法,为进一步鉴定低丰度和具有重要功能的橡胶粒子蛋白提供了参照体系。     

巴西橡胶成龄无性系茎段的试管微繁技术研究

巴西橡胶成龄无性系茎段组织培养在生产中有很大的潜在应用价值,但一直是橡胶树组织培养的难点,至今国内外鲜有成功的报道.本研究以在中国热带地区大面积推广种植的巴西橡胶树优良品种热研7-33-97不同生长时期成龄树茎段为外植体,进行无性系试管微繁技术研究.研究结果表明不同生长时期的茎段在自然条件中受污染程度不同,茎段真菌污染率为稳定期＞淡绿期＞古铜期,细菌污染率为淡绿期＞稳定期＞古铜期.不同生长时期的成龄树茎段需要通过不同的灭菌方法才能显著提高外植体的利用率,外植体灭菌方法显著影响橡胶成龄树茎段的组织培养效率;与稳定期相比,古铜期和淡绿期茎段在组织培养过程中诱导丛生芽萌芽快、萌芽多,是较优的外植体材料;古铜期和淡绿期茎段在激素配比为4.0～5.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L GA3的条件下能很好的诱导抽出丛生芽;丛生芽在激素配比为2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA,1.0 mg/t 6-BA+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA或0.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA的条件下能很好的诱导丛生芽抽出健壮的芽条;丛生芽抽出的健壮芽条在激素配比为0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA的条件下能较好的抽根成苗.外植体生长时期、激素种类和浓度配比都是影响巴西橡胶成龄无性系茎段的试管微繁的重要因素.     

Seasonal Changes of Cambial Activity and Phloem Development in Hevea brasiliensis

There is definitely seasonal activity in cambial growth in the trunk of Hevea brasi- liensis planted on Hainan Island and the cambial growth ceases during leaf-fail and leaf-absent period simultaneously with lower temperature and dries. The sieve elements founction for one-half year to two years. The variation in conducting-phloem thicknesses in a year is not significant and the conducting-phloem retains in about the same thickness during leaf-fall and leaf-absent period as that during the other periods in a year.     

AFLP Fingerprinting Analysis of Elite Hevea brasiliensis Germplasm

There are more than 6 000 clones of Hevea brasiliensis Mull. Ary germplasm in the germplasm garden of Chinese National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops and some of them are elite germplasm demonstrated by production and previous studies. AFLP (amplified fragment length polymorphism) fingerprinting analysis was performed on 25 clones (15 of Wickham clones and 10 of Amazon wild clones which possess phenotypes with high-yielding/low-yielding, cold-tolerance/cold-sensitivity, oidium-resistance/oidium-sensitivity, tapping panel dryness (TPD)/healthy) respectively through a 377 DNA sequencer (P. E. Corp.) and PAGE electrophoresis results were analyzed by using GeneScanTMand GenotypeTM Analysis software (P.E.Corp.). The fragment profiles of different clones were obtained. Five hundred and eighteen fragments were generated by two primer combinations screened from 64 primer combinations and 511 fragments appeared to be polymorphic (98.6%). Genetic distance ranged from 0.25 to 0.81 between clones and ranged from 0.07 to 0.17 within RRIM600 clone. A specific 320 bp fragment of the oidium-resistant clones was found through genotype analysis. These results showed that AFLP fingerprints were highly reproducible and powerful and can be widely used in germplasm identification and genetic diversity analysis of Hevea brasiliensis. In addition, based on the AFLP data, cluster analysis was performed. Cluster results showed that all the clones studied were almost clustered into a group one by one. 