DNA 去甲基化机制的研究进展*

DNA甲基化作为动植物体内一种重要的表观遗传修饰形式,在调控基因表达、维持基因组的稳定性等方面发挥重要的生物学作用。固有DNA甲基化水平和模式的变化会导致生物的表型异常甚至死亡。而5-甲基胞嘧啶的水平和模式是由DNA甲基化和去甲基化共同决定的。DNA去甲基化可以分为主动去甲基化与被动去甲基化,而基因组甲基化模式的形成主要依赖于主动去甲基化。本文综述了生物体内DNA主动去甲基化五种潜在机制:DNA转葡糖基酶参与的碱基切除修复途径、脱氨酶参与的碱基切除修复途径、核苷酸切除修复途径、氧化作用去甲基化与水解作用去甲基化。     

哺乳动物中的DNA主动去甲基化

DNA甲基化是一种相对稳定且可遗传的表观遗传标记,在植物和动物细胞中均发现有DNA主动去甲基化现象,其机制在植物中已基本得到阐释,但在哺乳动物中尚未鉴定出一种有效的DNA去甲基化酶,并且DNA主动去甲基化途径也存在争议。文章综合分析了近期的文献资料,阐述了哺乳动物中发生DNA主动去甲基化的时空特异性,并从细胞和组织特异性角度介绍DNA主动去甲基化的可能通路和机制,即5-甲基胞嘧啶的氧化作用、5-甲基胞嘧啶脱氨基以及DNA修复等,旨在为破译表观遗传重编程过程提供理论依据。     

DNA甲基化与植物的生长发育

文章就DNA甲基化与植物生长发育的关系、催化甲基化的酶、5－甲基胞嘧啶在植物基因组中的分布、甲基化的发生和遗传的研究进展作了介绍。     

纳米孔基因测序技术在DNA甲基化修饰检测中的应用研究进展

DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰类型之一,其中哺乳动物基因组中最常见的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)甲基化修饰参与了许多重要的生命活动,其含量的异常与疾病,尤其是癌症的发生发展密切相关。当前检测5mC修饰最常用的方法是基于亚硫酸氢盐转化的第二代基因测序技术,该方法虽然转化效率高且测定准确,但仍然存在不足之处,包括DNA分子降解、处理过程繁杂、测序读长较短、检测特异性不高等。近些年发展起来的纳米孔基因测序技术凭借其能对DNA修饰直接进行检测,且具有读长长、通量高、速度快等特点,在DNA表观遗传修饰检测方面展现了良好优势。本文对DNA的5mC修饰的形成及其经典的检测方法进行了简要介绍,并重点介绍了纳米孔基因测序技术在DNA的5mC修饰检测中的应用研究进展。     

脊椎动物父系基因组主动去甲基化研究进展

基因组表观遗传重组出现在细胞发育潜能发生变化的时期。早期植入前胚胎的表观遗传重新编程对于细胞分化和胚胎的生长发育是至关重要的,这涉及到表观遗传印记(尤其是DNA甲基化)的消除和重建过程。脊椎动物许多物种中,DNA复制起始前父系基因组通常要经历主动去甲基化,而母系基因组则可以保持甲基化的状态不变,直到在随后的卵裂过程中被动去甲基化。综述了脊椎动物父系基因组主动去甲基化的机制,这种去甲基化在脊椎动物各物种间的差异,以及影响这种主动去甲基化机制的因素。另外,研究外源基因表达的表观调控机制(尤其是表观遗传重编程的异常现象)有利于理解转基因克隆水产动物中普遍存在的授精成功率较低,基因整合率较低,以及胚胎发育异常等现象,有利于更好地应用转基因克隆技术。     

DNA甲基化作用对细胞癌变的影响

５－甲基胞嘧啶的形成引起自发脱氨是真核生物中一种普遍存在的内源突变过程。ＤＮＡ甲基化酶具有突变诱导物作用并在癌变中表达增加。癌细胞基因组呈现ＤＮＡ甲基化不足而影响基因组的稳定性;组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化;癌基因多为不充分甲基化导到重新开放或异常表达;抑癌基因多为过度甲基化从而形成突变靶点。ＤＮＡ甲基化效应物可改变癌变相关基因的表达。     

TET蛋白：一个新的DNA修饰酶家族

DNA的胞嘧啶（C）5-甲基化是一种重要的表观修饰,它参与基因调节、基因组印记、X-染色体失活、重复序列抑制和癌症发生等过程. 5-甲基胞嘧啶（5mC）可被TET (ten-eleven translocation)蛋白家族进一步转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）,该过程是DNA去甲基化的1个必要阶段. 5hmC可在活性转录基因起始位点和Polycomb抑制基因启动子延伸区域富集.TET蛋白包括3个成员TET1、TET2和TET3,均属于α-酮戊二酸和Fe²⁺依赖的双加氧酶,其催化涉及氧化过程.小鼠Tet1在胚胎干细胞发育中拥有双重作用,即促进全能因子的转录,又参与发育调节因子的抑制.人TET蛋白的破坏与造血系统肿瘤相关,如在骨髓增生性疾病/肿瘤存在频繁的TET2基因突变.TET蛋白和5hmC的研究为DNA甲基化/去甲基化及其生物学功能提供了新的视点.     

植物表观遗传与DNA甲基化

表观遗传在植物生长发育过程中起着极其重要的作用。甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式,是调节基因功能的重要手段。介绍了植物体中胞嘧啶甲基化现象,RNA指导的DNA甲基化的信号分子、作用机制,以及与RNA介导的基因沉默机制之间的区别和RNA对转座子的表观控制。     

甲基化特异性PCR检测FMR1 和XIST基因甲基化实验方法的建立

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因（Fragile X mental retardation, FMR1）和X染色体失活基因（X chromosome inactivation,XIST）甲基化的方法,用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰。以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对：1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因（CGG）n重复序列区、FMR1 和XIST 基因的启动子区。PCR产物进一步克隆、测序。以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板,进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物。测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变。成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法。     

DNA去甲基化对细胞衰老的影响

5-氮杂胞嘧啶（5aZaC）为DNA甲基化转移酶的抑制剂,用它处理细胞,使基因组DNA去甲基化．结果发现,经5aZaC处理后的细胞衰老进程明显加快,这从另一侧面反映了DNA甲基化与细胞衰老的关系．     

DNA甲基化和去甲基化的研究现状及思考

DNA甲基化通过调节基因转录、印记、X染色体灭活和防御外源性遗传物质入侵等, 在细胞分化、胚胎发育、环境适应和疾病发生发展上发挥重要作用, 是当前表观遗传学研究的热点领域之一。文章介绍了在过去几年中TET介导的DNA羟甲基化及其在早期胚胎发育中的作用, DNA主动去甲基化及其与被动去甲基化的关系, DNA甲基化建立及其与组蛋白修饰、染色质构象、多梳蛋白和非编码RNA结合等关系方面的重要研究进展和存在的问题以及DNA甲基化的转化应用前景。     

Hi-Meth：特定位点DNA甲基化高通量检测平台

胞嘧啶甲基化是DNA表观遗传修饰的主要类型之一,在维持正常细胞功能和调控基因表达中具有重要作用。重亚硫酸盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)是特异性位点DNA甲基化检测的通用方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但此方法需要大量的单克隆测序,操作过程较繁琐、成本昂贵。因此,开发准确、高效、便捷的DNA甲基化检测技术对提升表观遗传研究效率具有重要意义。基于本课题组开发的高通量突变类型检测平台Hi-TOM (high-throughput tracking of mutations),我们进一步建立了特定位点DNA甲基化高通量检测平台Hi-Meth (high-throughput detection of DNA methylation)。DNA样品通过重亚硫酸盐处理之后,仅需一轮PCR扩增即可通过Hi-Meth平台获得特定位点DNA甲基化分析结果。利用Hi-Meth平台,对水稻不同基因启动子区域进行了DNA甲基化检测分析,并与基于BSP方法获得的结果进行了比较。结果表明,Hi-Meth策略与BSP策略检测结果基本一致。而且通过Hi-Meth平台可以更准确、便捷地获得特异性位点DNA甲基化分析结果。综上所述,Hi-Meth为特定DNA区域提供了重要的甲基化检测平台,对表观遗传研究具有重要意义。     

牛不同供体核克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度的比较研究

利用亚硫酸氢盐测序法分析Holstein奶牛胎儿成纤维细胞(FFB)和输卵管上皮细胞(FOV)来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化状况,以体外受精囊胚(IVF)和供体细胞作对照.克隆囊胚Xist基因处于较低程度的DNA甲基化状态,其中,FFB来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度为43%,而FOV来源的克隆囊胚仅为17%.在体外受精囊胚中,Xist基因DNA甲基化处于中等状态,为49%.然而,在体细胞中,Xist基因的甲基化程度较高,FFB为66%,FOV为63%.这些结果说明,Xist基因DNA甲基化是可以被重编程的,所检测的CpG岛可能调节Xist基因的表达.结合已发表的实验数据,在同一个体中,FFB来源的克隆囊胚发育率比FOV的低,但其克隆牛胎儿的妊娠率和产犊率比FOV的高,这暗示不同供体核克隆囊胚的重编程是有差异的,并可能影响到胚胎及个体的发育.     

极性生长的细胞中胞嘧啶甲基化的动态变化及其对GABA信号的响应

DNA胞嘧啶(C)的甲基化(5m C)在植物发育过程中具有重要的调节作用,多种环境因子如逆境胁迫、植物内/外源性因子等均会触发DNA甲基化的变化。为探讨γ-氨基丁酸(GABA)对植物发育的可能调节机制,本研究以极性生长的烟草花粉管和拟南芥根为材料,分析5m C的含量及其对GABA信号的响应。结果表明,1.0 mmol/L GABA能显著促进烟草花粉管和拟南芥根的极性生长;同时,GABA处理使烟草花粉管和拟南芥根的基因组中5m C含量显著降低、5-羟基胞嘧啶(5hm C)含量显著增加。5hm C是5m C去甲基化途径中的一个重要中间产物,本研究证实了GABA可以作为一种重要的外源信号调节DNA甲基化的动态变化。     

牛体外受精胚胎的基因组甲基化模式

利用抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)抗体免疫荧光法检测了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)的牛合子及早期胚胎的基因组甲基化模式. 实验结果表明: 有61.5%的合子发生了雄原核去甲基化, 而34.6%的合子没有发生去甲基化; 当胚胎发育到8-细胞时, 甲基化水平明显下降, 且一直到桑椹胚期仍维持低甲基化状态, 但同一枚胚胎的不同卵裂球之间甲基化水平不同; 在囊胚期, 内细胞团细胞的甲基化水平很低, 而滋养层细胞的甲基化水平却很高. 本研究结果至少部分地提示, IVM/IVF/IVC可能对牛合子及早期胚胎的甲基化模式有一定影响.     

表观遗传学与人类疾病的研究进展

在过去的几年里,人们对表观遗传疾病的机理有了新的认识,这些疾病与染色质重塑、基因组印记、X染色体失活以及非编码RNA调控这4个表观遗传过程相关。这4个过程通过调节染色质结构,在染色体或基因簇水平上对基因表达进行调控;异常调控导致复杂的突变且表现为出生前后生长发育和神经功能的异常。对这些疾病的探讨为表观遗传机制的研究提供了很好的模型,进而有助于生物医学的研究。文章就表观遗传学和表观遗传疾病机制的研究进展做一综述。     

5-azaC对人体成纤维细胞失活X染色体DNA复制带型的影响

本文用胞苷的类似物5-氮胞苷(5-azaC)处理两种人体皮肤成纤维细胞——46,XX和46,Xt(X;1)。经过一定时间培养,观察用5-azaC处理人体成纤维细胞中失活X染色体复制带的变化。发现5-azac对迟复制X(LX)和t(X;1)染色体上有一条或多条复制带的染色增深,表示复制提前,大约比对照组提前复制1小时左右。同时发现t(X;1)染色体上,受X失活中心的失活扩散影响的1-10区段,用5-azac处理之后,也有复制提前。复制提前这一现象,从另一方面支持了DNA甲基化,可能是人类X染色体失活的一种机理。     

5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子的去甲基化作用

探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza-dC)对人急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞的增殖抑制作用及对RASSF10基因启动子甲基化状态的影响。体外培养Molt-4细胞,采用不同浓度5-Aza-dC对Molt-4细胞进行处理。采用MTT法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR法检测RASSF10 mRNA表达的变化,Westernblot检测RASSF10蛋白表达的变化,COBRA实验检测RASSF10甲基化水平。一定浓度的5-Aza-dC作用Molt-4细胞后,细胞增殖抑制率显著升高,且具有时间和剂量依赖性。对照组Molt-4细胞未检出RASSF10 mRNA及蛋白表达,而5-Aza-dC处理组检出RASSF10基因重新表达。COBRA实验结果提示对照组Molt-4细胞中存在启动子高甲基化的现象,而5-Aza-dC处理组Molt-4细胞的RASSF10基因被部分去甲基化。甲基化抑制剂5-Aza-dC可通过对RASSF10基因的去甲基化作用,重新恢复RASSF10的表达,从而抑制Molt-4细胞的增殖。     

拟南芥DNA去甲基化基因RLL4的定位与功能分析

该研究以携带2×35S:LUC报告基因的转基因拟南芥Col-LUC为亲本系,将其种子进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变,在M2代筛选出1株低荧光的候选突变体,命名为rll4(reduced LUC luminescence 4)。遗传学分析表明,rll4突变位点包含1个核基因隐性突变。图位克隆技术定位结果显示,突变基因的位点位于4号染色体2个分子标记CL417-B10M1和CL418-B2M2之间,这2个分子标记分别位于F20D10和F20M13BAC(bacterial artificial chromosome)克隆。酶切PCR(Chop-PCR)结果显示,rll4突变体中基因组DNA的部分位点甲基化显著升高。反转录PCR(RT-PCR)结果显示,rll4突变体中ROS1(REPRESSOR OF SILENCING 1)的表达量并没有明显变化,而一些RNA介导的DNA甲基化(RdDM)过程靶位点的基因表达量有明显下降。研究表明,RLL4位点很可能参与了拟南芥DNA去甲基化过程。