cDNA文库构建方法的进展

cDNA文库构建是基因克隆的重要方法之一。从cDNA文库中能够筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达,它是发现新基因和研究基因功能的基础工具,本文介绍几种cDNA文库构建中的改进技术,并着重阐述其原理和特点。     

眼镜蛇毒腺cDNA文库构建

目的 蛇毒含有多种生物活性成分,从天然蛇毒中提取分离蛇毒有效成分受到蛇毒资源和质量的限制。为开发蛇毒有效成分的基因工程产品,本研究构建了蛇毒腺的ｃＤＮＡ文库,为进一步筛选,克隆和表达螺毒有关基因做准备。方法 从眼镜蛇毒腺中提取ｍＲＮＡ,经反转录合成ｃＤＮＡ后,以λｇｔ１０噬菌体为载体,构建非表达的ｃＤＮＡ文加。     

PCR介导的cDNA文库矩阵排列筛选方法

描述了一种快速、有效的ｃＤＮＡ库筛选策略。其主要过程是将ｃＤＮＡ库重组子进行矩阵排列,进而用特异引物进行ＰＣＲ逐级筛选以分离目的基因。     

PCR介导的cDNA文库矩阵排列筛选方法

描述了一种快速、有效的ｃＤＮＡ文库筛选策略。其主要过程是将ｃＤＮＡ文库重组子进行矩阵排列,进而用特异引物进行ＰＣＲ逐级筛选以分离目的基因．     

应用cDNA文库快速构建法克隆高粱肌动蛋白基因

取生长一周的高粱嫩叶为材料,按照ｃＤＮＡ库快速构建法,用λｇｔ１０为载体成功地获得了含有２×１０＾０６人重组噬菌体的ｃＤＮＡ库。以水稻ＲＡｃｌ ｃＤＮＡ为探针,经噬菌体原位杂交筛选出两个阳性克隆片段,并对其中一个进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定。然后将重组体中含有的ｃＤＮＡ片段亚克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ－载体上测序。     

荷花花蕾cDNA文库构建及质量评价

为理解荷花Nelumbo nucifera花器官转录组表达情况,分别选取不同花型的代表品种‘洪湖红莲’Nelumbo nucifera ‘Honghu Honglian’(单瓣)、‘唐招提寺莲’N. nucifera ‘Tangzhaotisi Lian’(重瓣)和‘千瓣莲’N. nucifera ‘Qianban Lian’(千瓣及全重瓣)的花蕾为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA,经限制性内切酶SfiI酶切后回收去掉接头和500 bp以下片段的cDNA。将cDNA与pUC19载体连接,构建荷花花蕾cDNA文库。经检测,该文库容量为1.12 × 106 pfu·mL-1,插入片段大小集中在500～2000 bp,重组率为95%。该文库的成功构建为荷花花蕾期转录组数据的开发及其花器官发育相关基因的功能研究奠定了分子基础。     

一种构建 cDNA 文库时 Sepharose CL-4B 筛分 cDNA 的简化方法

构建 cDNA 文库时,为了提高获得全长 cDNA 的可能性,在进行连接和包装反应之前,应当采用Sepharose CL-4B 柱层析对 cDNA 首先进行筛分。一般的方法是在提取 mRNA 之后,利用逆转录酶合成cDNA 第一链,然后直接在第一链反应混合液中加入同位素、RNase H 和 E.coli DNA 聚合酶 I 示踪合成cDNA 第二链,再进行甲基化、连接接头并以限制性内切酶消化,上 Sepharose CL-4B 柱层析进行分离。显然这一程序由于多次使用同位素,增加了放射污染材料扩散的可能,也给整个实验过程带来不便。     

cDNA文库固相构建法

本文介绍一种ｃＤＮＡ文库的固相构建法。文库构建过程ｃＤＮＡ的合成和修饰全部在固相介质－磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的ｃＤＮＡ文库构建,是一种植得借鉴和应用的好办法。     

几种cDNA差减文库构建方法的比较

ｃＤＮＡ差减文库的构建是研究基因差异表达、缩小目的基因筛选范围的理想方法。近年来报道了多种构建方法,并形成了两个发展趋势,但目前还无一种方法被普遍认可。现就几种常见方法的原理、思路及优缺点进行了比较,以供借鉴。     

水稻精细胞cDNA文库的构建及分析

利用Percoll密度梯度离心和多次滤膜过滤分离到适于分子生物学研究的水稻 (OryzasativaL .cv .Guichao2 )生活精细胞。借助RT_PCR和SMART技术构建了水稻精细胞的cDNA文库。初级文库的大小为 1.5 8× 10 6 pfu ,插入片段平均大小为 980bp。 10 3个随机挑选的克隆与DIG标记的水稻幼苗根、叶及二细胞时期花粉、成熟花粉、精细胞和授粉 5～ 7d的子房cDNA探针杂交表明 ,除少数克隆外 ,它们在上述器官中的表达情况很相似。 10个随机挑选的克隆用来测序及分析 ,有 4个克隆含有完整的开放阅读框。 1个克隆与水稻Polyubiquitin (Rubq1)mRNA高度同源。Northern杂交表明它在二细胞时期花粉、成熟花粉中的表达显著少于在根、叶和授粉子房中的表达。另一个克隆的开放阅读框编码与拟南芥 (Arabidopsisthaliana (L .)Heynh .)AtRAD17同源的蛋白。这是第一次正式报道高等植物精细胞cDNA文库的构建 ,也是第一次从高等植物精细胞中分离到其表达的基因。     

微量RNA的cDNA PCR文库的构建

使用PCR（polymerase chain reaction)技术,调制了mRNA的cDNA PCR文库,实验证明,cDNA PCR文库能使原cDNA的量放大数百倍,同时,使用人体K562培养细胞的总RNA,对cDNA PCR文库法和反转录中的β-Actin的cDNA量进行了比较,cDNA PCR文库法中的β-Actin的cDNA量大于高于反转录中的β-Actin的cDNA量,使用75pg的人体K562培养细胞的总RNA,调制成50ul的CDNA PCR文库,使用1ul的CDNA PCR文库进行了PCR反应时,可对文库中β-Actin的CDNA进行PCR检测,因此,CDNA PCR文库显示了良好的信息放大性能。     

快速简便筛选cDNA文库的SSS法

建立了一种快速简便筛选cDNA文库的方法—SSS法（subsection screening）。该方法用cDNA噬菌体平板划块分组和根据目的基因设计的一对特异性引物,用PCR技术逐级筛选cDNA文库获得目的基因。与其它筛选cDNA文库的方法相比,该方法范围可控,目标明确,易于获得目的基因,而且快速、简捷、省时,一般可在一周内筛选出目的基因。本实验室利用该方法在半个月内筛选出了一个查耳酮异构酶(chalcone isomerase)(CHI)基因,一个黄酮类化合物3′-羟化酶(flavonoid 3′hydroxylase)(F3′H)基因,一个热激蛋白(heat shock protein)(HSP)基因和一个1 484 bp 热激蛋白基因片段。此方法用于同时筛选多个基因,可收到事半功倍的效果,对其它文库筛选也有借鉴意义。 Abstract:A quick and simple method subsection screening (SSS) method for screening cDNA library by PCR was established.With this method,cDNA phage plate was cut into several blocks and a couple of primers was designed according to target gene.And then the target genes were obtained by screening cDNA library.Comparing with other methods,this method has many advantages such as controlled range and clear target,and also quick and simple for obtaining the target genes.It is possible to get a target gene in one week in general by this method.Thus,the CHI gene,F3′H gene,HSP gene and one HSP partial fragment,were obtained respectively in half month in our lab.We can get twice the result with half the effort when we screen several genes in the same time.It is also suitable to screen other libraries.     

基因预测与PCR技术相结合从cDNA文库中获取表达基因的研究

应用计算机工具、GenScan软件预测中国美利奴绵羊MHC Class I区段的BAC文库中453oⅡ克隆的基因数目、特性及结构,建立一种可以从cDNA文库中简便有效获取表达基因的技术方法。选取4个预测基因作研究对象设计引物,应用PCR技术,对已构建好的cDNA文库进行PCR扩增,回收"目的基因"片段并连接pGEM-T载体,转DH5α大肠杆菌中扩增后测序。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,cDNA文库中有目的条带,测序结果与GenBank进行Blast分析,分析结果表明这些基因与羊的基因均具有99%以上的相似性。因此应用基因预测分析与PCR结合技术可简便迅速的从cDNA文库中获取表达基因。     

一种适于PCR扩增的小麦基因组DNA快速提取法

许多小麦分子生物学研究需要对大量的小麦样品进行PCR检测,因此,建立一种快速提取小麦基因组DNA的方法十分必要。根据国外报道的一种快速提取水稻和玉米基因组DNA的方法,我们对部分提取步骤进行变动后,在小麦上进行了尝试,长度为1．5kb的片段能得到稳定的扩增。该方法样品研磨在1.5ml的离心管内进行,后续操作不用酚、氯仿、CTAB、SDS和巯基乙醇,整个提取过程不需要使用通风橱,操作步骤简单,花费时间少,而且提取的小麦基因组DNA完整性好,量也较可观。一个DNA样品可供50～100次PCR反应使用,适用于小麦遗传多样性、分子标记辅助选择、转基因后代检测以及引物筛选、分子标记定位等多种研究。     

一种适于转基因水稻PCR检测的微量DNA快速提取法

对已报道的小麦基因组DNA快速提取方法的部分步骤进行了简化,在水稻上进行了尝试。结果表明,简化法提取的水稻基因组DNA完整性好,PCR扩增效果与试剂盒提取法无明显的差异,结果稳定可靠;而且整个提取过程操作简单、花费时间少,样品用量少,仅需5-10mg,适用于大规模转基因水稻的PCR检测。     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

大鼠脑cDNA文库的构建

采用简单高效的cDNA合成技术制备Wistar大鼠脑cDNA基因文库,以纯化的poly( A)⁺－RNA为模板,含Not I切点的oligo－（dT）15为引物,在反转录酶的作用下,合成第一股单链cDNA;用E.coli RNase H除去模板RNA,并以E.coli DNA聚合酶Ｉ,E.coli DNA连接酶和T4 DNA聚合酶催化合成cDNA第二条链,即成为双链cDNA;此双股cDNA除0．5μg用于插入pSPORT I载体,转入E.coli DH5a,建成cDNA文库外,其余保存在－20℃,以此cDNA为模板,应用PCR方法,先后克隆了谷氨酸脱羧酶（GAD,1800bp）、神经元特异性烯醇化酶（NSE,1340bp）,甲状腺激素受体（T3－receptor,1230bp）、胆囊收缩素（CCK,345bp）的全编码基因．     

从cDNA文库中筛选分析阳性克隆的简便方法

cDNA文库中阳性克隆的传统筛选分析法既费时又费力.利用微波炉加热的方法,简化了原位杂交中噬菌斑裂解、DNA变性与固定的程序;进一步运用PCR扩增技术,特异扩增克隆载体中插入的cDNA片段,加快了阳性克隆分析的进程.