褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

褐飞虱中肠内膜结合短肽P2S的筛选

筛选与褐飞虱Nilaparvata lugens中肠内膜相结合的短肽, 探索能阻断褐飞虱传播水稻病毒的新方法。【方法】通过改良的膜饲喂法和噬菌体短肽文库展示技术, 模拟褐飞虱正常取食的行为, 筛选能够与其中肠内膜结合的短肽。将筛选到的短肽与加强绿色荧光蛋白进行融合表达, 经纯化后, 将融合蛋白饲喂给褐飞虱若虫, 通过荧光显微镜观察饲喂后若虫的中肠。【结果】使用改良的膜饲喂法, 16 h后褐飞虱若虫的取食率达到91%, 24 h后达到95%。经形态学验证, 确定了一种短肽与褐飞虱中肠内膜具有结合活性, 并将其命名为P2S。【结论】改良了针对褐飞虱的膜饲喂法, 筛选并验证了能够与褐飞虱中肠内膜结合的活性短肽P2S。研究结果为阻断相关的水稻病毒与褐飞虱中肠内膜间的相互作用研究提供了科学依据, 也为褐飞虱新型膜穿孔毒素蛋白的研究提供了理论基础。     

三种稻飞虱体内类酵母共生菌18S rDNA和 ITS 5.8S rDNA序列克隆及进化分析

为研究水稻3种主要害虫灰飞虱Laodelphax striatellus、 褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera体内类酵母共生菌（yeast-like symbiotes, YLS）的种属地位及与寄主的进化关系, 测定了其体内YLS的18S rDNA及ITS-5.8S rDNA的全长序列。基于3种稻飞虱体内YLS的18S rDNA序列比对表明, 褐飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与灰飞虱YLS的高（褐飞虱YLS和白背飞虱YLS为98.91%, 灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为95.74%, 灰飞虱YLS和白背飞虱YLS为96.02%）, 而基于ITS-5.8S rDNA序列比对, 灰飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与褐飞虱YLS的要高（白背飞虱YLS和灰飞虱YLS为99.57%, 灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为91.91%, 白背飞虱YLS和褐飞虱YLS为90.46%）。基于真菌18S rDNA和ITS-5.8S rDNA的系统发育树均表明, 3种稻飞虱体内YLS与其他已知真菌进化关系较远。本研究证实了昆虫真菌类共生菌与寄主形成了长期的进化关系, 从而形成了不同于已知真菌的分类地位。     

Phylogenetic position of yeast-like symbiotes from three rice planthoppers (Homoptera: Delphacidae ) based on 18S rDNA and ITS-5.8S rDNA sequences

为研究水稻3种主要害虫灰飞虱Laodelphax striatellus、褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera体内类酵母共生菌( yeast-like symbiotes,YLS)的种属地位及与寄主的进化关系,测定了其体内YIS的18SrDNA及ITS-5.8S rDNA的全长序列.基于3种稻飞虱体内YLS的18S rDNA序列比对表明,褐飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与灰飞虱YLs的高(褐飞虱YLS和白背飞虱YLS为98.91％,灰飞虱YLS和褐飞虱YLS为95.74％,灰飞虱YLS和白背飞虱YLS为96.02％),而基于ITS-5.8S rDNA序列比对,灰飞虱YLS和白背飞虱YLS的一致性比其与褐飞虱YLS的要高(白背飞虱YLS和灰飞虱YLS为99.57％,灰飞虱YLS和褐飞虱YIS为91.91％,白背飞虱YLS和褐飞虱YLS为90.46％).基于真菌18S rDNA和ITS-5.8S rDNA的系统发育树均表明,3种稻飞虱体内YLS与其他已知真菌进化关系较远.本研究证实了昆虫真菌类共生菌与寄主形成了长期的进化关系,从而形成了不同于已知真菌的分类地位.     

不同地理种群褐飞虱体内共生酵母菌的个体大小及数量差异

褐飞虱腹部脂肪体内普遍存在共生酵母菌,该类共生菌在褐飞虱的生理代谢和营养利用等方面起着重要作用。采用冷冻切片技术结合显微摄像系统观察法测定不同地理种群褐飞虱体内共生酵母菌的个体大小和数量。试验结果表明,不同地理种群褐飞虱雌(雄)成虫体内共生菌的个体大小和数量差异显著,依次为:对照种群>广西种群>浙江种群>福建种群。结合虫体内脂肪和糖元含量的分析得出,褐飞虱体内共生酵母菌的长、宽度和数量与脂肪和糖元含量显著正相关。文章从共生酵母菌的角度解释了不同地理种群褐飞虱致害性变异的内在原因,并推测,迁飞过程所导致的褐飞虱体内脂肪和糖元的消耗影响了该类共生菌的数量和质量,并最终导致褐飞虱对抗性品种水稻的致害性减弱。     

褐飞虱属的两个新种记述

褐飞虱属Nilaparvata Distant,1960在全世界共记录有16种,在我国及邻近地区常见的是褐飞虱Nilaparvata lugen(Stal),拟褐飞虱Nilaparvata bakeri(Muir)和伪褐飞虱(Nilaparvata muiri China等,其中褐飞虱是水稻上的重要害虫。最近在整理从云南省思茅采集的飞虱标本中,发现有褐飞虱属的2个新种,分别命名为线斑褐飞虱Nilaparvata lineolae Huang et Tian 和粟褐飞虱 Nilaparvata castaneaHuang et Ding。褐飞虱属的主要特征是后足第1附节上有一到数个小刺,易于和飞虱科中的其它各属相区别,但褐飞虱属中的种类在形态上都很相似,为了避免与害稻的褐飞虱相混淆,兹将褐飞虱属的两个新种给予描述。新种模式标本保存在南京农学院植保系昆虫标本室。     

三种稻田常见螯蜂对半翅目害虫的寄主偏好性及控害作用

【目的】探明两色食虱螯蜂Echthrodelphax fairchildii、黄腿双距螯蜂Gonatopus flavifemur和稻虱红单节螯蜂Haplogonatopus apicalis 3种稻田常见螯蜂对半翅目害虫的寄主偏好性及控害作用。【方法】在非选择条件下,分别以褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera、灰飞虱Laodelphax striatellus、黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps和伪褐飞虱Nilaparvata muiri为寄主,观察两色食虱螯蜂、黄腿双距螯蜂和稻虱红单节螯蜂的取食、寄生以及子代生长发育情况;并在选择条件下观察3种螯蜂对稻飞虱的寄主选择性,评价螯蜂的寄主偏好性。根据以上试验,评出3种螯蜂各自的适宜寄主;并选择适宜寄主测定3种螯蜂的寿命、取食量和寄生量,评价其控害作用。【结果】两色食虱螯蜂可取食和寄生褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱和伪褐飞虱,以前3种为两色食虱螯蜂的适宜寄主,伪褐飞虱次之;黑尾叶蝉为其非取食、寄生寄主。黄腿双距螯蜂可取食和寄生4种飞虱：褐飞虱和灰飞虱适合性较高,白背飞虱次之,伪褐飞虱最差。黑尾叶蝉可为黄腿双距螯蜂的取食寄主,但非寄生寄主。稻虱红单节螯蜂以白背飞虱为最适寄主,灰飞虱次之;其他3种寄主仅能被稻虱红单节螯蜂取食,不能被成功寄生。在适宜寄主上,稻虱红单节螯蜂雌虫的寿命、总取食和寄生合计量均最高,两色食虱螯蜂的最低,黄腿双距螯蜂的居中;3种螯蜂日均取食量和寄生量的消长动态波动幅度不大。【结论】两色食虱螯蜂偏好寄生褐飞虱、灰飞虱和白背飞虱,控害作用相对最弱;黄腿双距螯蜂偏好寄生褐飞虱和灰飞虱,控害作用居中;稻虱红单节螯蜂偏好寄生白背飞虱,控害作用最强。     

水稻抗褐飞虱基因研究和利用现状

稻褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）是一种单食性水稻害虫,根据其对水稻品种的危害,可分为生物型1、2、3、4等类型。它对亚洲各国水稻生产造成极大危害。实践证明,利用抗虫品种是防治稻褐飞虱最经济有效的方法。本文综述了稻褐飞虱的生物学特征和分布、生物类型,着重介绍抗稻褐飞虱基因的研究和利用现状,并对今后开展抗稻褐飞虱基因研究提出几点建议。     

华中地区五种水稻品种对褐飞虱生活史和种群动态的影响

【目的】通过研究华中地区5种主栽水稻品种对褐飞虱Nilaparvata lugens (St?l)生活史和种群动态的影响,评价褐飞虱个体和种群对5种水稻品种的取食适应性特征,为华中地区主栽水稻的应用推广和褐飞虱的防控提供数据参考。【方法】利用两性生命表理论,研究华中地区5种水稻("深两优3117"、"金优957"、"齐两优908"、"丰优989"、"汕优63")对褐飞虱生活史参数的影响,并用软件模拟5种水稻喂饲下褐飞虱种群动态发生情况。【结果】不同水稻品种对褐飞虱4-5龄若虫的影响最大,取食"齐两优908"后褐飞虱发育历期较其他水稻品种显著延迟(P0.05);"汕优63"和"金优957"饲喂下的褐飞虱产卵量显著低于其它3种水稻品种(P0.05);"齐两优908"喂饲处理下,褐飞虱成活率较其他4种水稻品种显著降低(P 0.05)。褐飞虱在5种水稻品的净增值率(R0)由高到低依次为"丰优989""深两优3117""汕优63""金优957""齐两优908"。【结论】华中地区5种主栽水稻品种,"齐两优908"对褐飞虱成活率具有显著的降低效果;褐飞虱取食"丰优989"和"深两优3117"后种群净增值率最高。     

褐飞虱与灰飞虱间接种内和种间效应的比较研究

为了明确褐飞虱Nilaparva talugens(Stl)与灰飞虱Laodelphgax striatellus(Fallén)经寄主植物而诱导引起的间接种间效应,在人工气候室内以健康植株为对照,研究了2种飞虱在事先分别经一种稻飞虱危害的汕优63和秀水11上的表现,比较由同种或异种诱导的间接种内和种间效应对该2种稻飞虱主要生物学参数的影响,结果表明在每2株稻苗接20头高龄单一种飞虱若虫危害2d的条件下,褐飞虱存在一定的间接种内竞争,主要表现为在事先由同种危害的寄主上若虫存活率显著下降,但未发现灰飞虱对褐飞虱的正面或负面的间接种间效应。但是,在试验条件下灰飞虱并不存在间接种内竞争,而存在着显著的褐飞虱对灰飞虱诱导的间接种间促进作用,主要表现为在事先经褐飞虱取食危害的寄主植物上灰飞虱若虫的历期缩短、存活率提高、雌成虫寿命延长、每雌产卵量增加。同时,褐飞虱对灰飞虱所表现的间接诱导种间促进效应与寄主品种有显著互作关系,在中抗灰飞虱的汕优63品种上,间接诱导种间促进效应较在感灰飞虱品种秀水10上更为明显。本文对稻飞虱间接诱导种内和种间效应的机制和进化意义进行了讨论。     

红褐斑腿蝗卵黄蛋白的分离纯化及性质分析

用蒸馏水沉淀法、凝胶过滤、蛋白质电泳等方法提取纯化了红褐斑腿蝗Catantops pinguis (Stål)的卵黄蛋白,并对其性质进行了分析。电泳结合不同的染色方法证明红褐斑腿蝗的卵黄蛋白为一种糖脂复合蛋白,其分子量约为548 kD,由7个亚基组成,亚基分子量分别为147.3,100.2,95.9,59.6,53.6,49.0和42.2 kD。卵黄蛋白经高效液相色谱分析检测到17种氨基酸和NH₃峰,其中谷氨酸（Glu）百分含量最高,达13.46%,天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、半胱氨酸（Cys）、精氨酸（Arg）含量比较高,脯氨酸（Pro）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）含量较低。     

龟纹瓢虫卵黄蛋白的分子特性及发生动态

研究了龟纹瓢虫Propylea japonica (Thunberg) 卵黄蛋白的基本特性以及卵黄发生过程中卵黄蛋白的动态变化。PAGE和SDS-PAGE实验表明,龟纹瓢虫卵黄蛋白分子量为294.81±40.70 kD,并由分子量分别为144.68±0.03 kD和51.23±0.27 kD的两种亚基组成。对卵黄蛋白的氨基酸组成和含量分析发现,其必需氨基酸总量占57.48％,略高于非必需氨基酸,其中谷氨酸（Glu）含量最高,为15.26％;色氨酸（Trp）和蛋氨酸（Met）含量较低,分别为0.50％和0.11％。采用间接竞争ELISA法,系统测定了龟纹瓢虫成虫期脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄蛋白的动态变化,结果表明：脂肪体是卵黄原蛋白合成的场所,卵黄原蛋白的合成始于羽化后第2天;脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白的滴度在羽化后第4天开始迅速上升,至成虫期的第8天左右达到高峰期。     

Photosynthesis and translocation of assimilates in rice plants following phloem feeding by the planthopper Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae)

Experiments were conducted to measure the effect of feeding by the planthopper Nilaparvata lugens (St?l) on photosynthesis and the translocation of assimilates in rice plants, Oryza sativa L. We used mature japonica rice plants and applied the 13CO2 feeding method to evaluate those physiological effects. The photosynthetic rate was suppressed by N. lugens infestation, especially at the lower leaf position, with rates 30% lower than that of control plants at the booting stage. Leaf nitrogen concentration in infested plants was also lower than that in control plants. After flowering, the chlorophyll content and total plant dry weight were reduced by N. lugens. Stem and sheath dry weights were significantly reduced by N. lugens infestation, whereas panicle dry weight was not affected. Little effect was found on disruption in translocation of assimilates, even when 13CO2 was supplied to the infested leaves. Results suggested that removal of assimilates and reduction in photosynthesis by N. lugens have the greatest effect on growth and yield of rice plants as compared with the disruption in the translocation of assimilates. Plant death can occur by N. lugens infestation if the amount of energy supplied is less than that required for tissue maintenance.     

褐飞虱中肠两种氨肽酶N的鉴定及蛋白特性分析

【目的】氨肽酶N(aminopeptidase N, APN)是昆虫消化系统中重要的蛋白酶。本研究旨在对在褐飞虱Nilaparvata lugens中肠中两个具有较高转录水平的apn基因(nlapn1和nlapn4)在中肠上皮细胞上的表达及其蛋白功能特性进行鉴定与分析。【方法】利用最大似然法进行褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的系统进化分析；利用Western blot分析NLAPN1及NLAPN4在中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles, BBMVs)中的定位；利用LC-ESI-MS/MS技术对Western blot定位的NLAPN1及NLAPN4进行鉴定。在果蝇Drosophila S2细胞内分别表达两个NLAPN蛋白，并利用Western blot及免疫荧光定位技术对NLAPN1与NLAPN4进行S2细胞内的定位；分别以L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)为底物测定NLAPN1和NLAPN4的酶活性。【结果】系统进化树分析结果显示，褐飞虱NLAPN1及NLAPN4与其他半翅目昆虫肠道中高表达的APN分在了同一分支中。Western blot及LC-ESI-MS/MS质谱分析结果证明NLAPN1与NLAPN4均存在于褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡中，分子量约为160 kD。Western blot及免疫荧光定位结果显示，两个NLAPN蛋白均位于S2细胞膜上，而C端缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定位点的NLAPN4lackG蛋白分布在细胞质中。酶活性测定结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐为底物时NLAPN1和NLAPN4都具有一定的酶活性，而以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物时NLAPN1有极高的酶活性(＞60 U/mg)。【结论】NLAPN1与NLAPN4是褐飞虱中肠上皮细胞膜上高表达的两个膜结合APN蛋白，且都通过C端的GPI锚定附着在细胞膜上。NLAPN1与NLAPN4与鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫中肠膜结合APN有着近似的蛋白结构与酶学特性。膜结合APN在褐飞虱中肠中的生理生化功能及其与外源病原物的互作机制还有待进一步深入研究。     

Brown planthopper, Nilaparvata lugens, resistance in rice cultivar IR64: mechanism and role in successful N. lugens management in Central Luzon, Philippines

We investigated the mechanism of brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål), resistance in the popular rice cultivar IR64, and the current level of resistance of IR64 to N. lugens in a large rice growing area with low brown planthopper populations (Central Luzon, Philippines). In greenhouse experiments with N. lugens populations collected from Central Luzon, IR64 showed slight to moderate levels of antibiosis, antixenosis, and tolerance relative to the cultivars IR22 and Azucena, which contain no major genes for N. lugens resistance. IR64 was also more resistant than IR26 in most experiments, despite the fact that both varieties have the same major gene for N. lugens resistance, Bph1. This confirms that IR64 contains one or more additional, apparently minor, genes for brown planthopper resistance. Our findings also demonstrate that, in an area with low insecticide use, it is not necessary to have high levels of N. lugens resistance, even in a rice cultivar grown by the majority of farmers, to maintain low and stable N. lugens populations.     

褐飞虱特异引物的设计和评估

研究稻田生态系统中天敌对褐飞虱Nilaparvata lugens( St(a)l)的捕食非常重要,但很困难.本研究设计褐飞虱的PCR特异引物,并对利用从稻田66种稻田常见节肢动物中提取的DNA进行了特异性验证,得到褐飞虱的特异引物( Lug-F1a/Lug-R1),在实验室以拟环纹豹蛛Pardosa pseudoan...     

长角血蜱卵黄蛋白的纯化及其性质

用凝胶过滤与离子交换层析、蛋白质电泳和糖脂蛋白染色等方法提取纯化长角血蜱Haemaphysalis longicornis卵黄蛋白,并对其性质进行了研究。PAGE和SDS-PAGE分析表明,长角血蜱的卵黄蛋白只有一种,由8个亚基组成,亚基的相对分子质量分别为112 kD, 103 kD, 80 kD, 78 kD, 71 kD, 68 kD, 62 kD和52 kD,卵黄蛋白经苏丹黑B和希夫试剂染色呈阳性,表明是一种含血红素的糖脂蛋白。     

Categories and inheritance of resistance to Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae) in mutants of indica rice 'IR64'

Varietal mutants can be useful for developing durable resistance, understanding categories of resistance, and identifying candidate genes involved in defense responses. We used mutants of rice 'IR64' to isolate new sources of resistance to the planthopper Nilaparvata lugens (St?l) (Hemiptera: Delphacidae). We compared two mutants that showed a gain and loss of resistance to N. lugens, to determine the categories of resistance to this pest. Under choice tests, female planthoppers avoided settling and laid fewer eggs on the resistant mutant 'D518' than on the susceptible mutant D1131, susceptible check 'TN1', and wild-type IR64, indicating that antixenosis was the resistance category. Similarly, under no-choice conditions, planthoppers laid 29% fewer eggs in D518 than in IR64, but they oviposited more in 'D1131' and TN1. Honeydew excretion was greater on D1131 seedlings but slightly lower on D518 than on IR64. Nymphal survival and adult female weight did not differ among rice cultivars. D518 showed higher tolerance of N. lugens infestations than IR64. Genetic analysis of the F1, F2, and F3 populations derived from D518 x IR64 revealed that resistance in D518 is dominant and controlled by a single gene. Despite the variation in resistance to N. lugens, both mutants and IR64 performed similarly in the field. The mutant D518 is a new source of durable resistance to N. lugens, mainly due to enhanced antixenosis to female hoppers for settling and oviposition.