野油菜黄单胞菌NK-01编码生物合成多糖基因的克隆

采用甲基磺酸乙酯诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌⅠ部分酶切得到的野生型ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段,连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上,在Ｅ．ｃｏｌｉ中建立完整的ＮＫ－０１基因库。通过使一株不产多糖突变株在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下,分别与含基因库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群体进行三亲结合转移筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体,对接合后体进行的重组质粒的酶切分析表明,     

野油菜黄单胞菌L4生产黄单胞菌多糖的适宜条件

研究了野油菜黄单胞L4生产黄单胞菌多糖的适宜培养基和培养条件。培养基组成(g／L)为：蔗糖40—50,铵盐1．0—1．25,酵母膏2．0-3.0,CACO,3.0,MgsO4·7H2O 0．25,Na2HPO4·12H2O 0.1,柠檬酸0．01—0．10,pH7．5。种龄为48小时以上。在30℃于旋转式摇床(200r／min)上培养3天,发酵液粘度高达14000-16000cp。用乙醇沉淀得多糖28g／L以上。     

野油菜黄单胞菌NK-01的形态及黄原胶分泌的电镜研究

利用透射电镜,研究了野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)NK-01菌株培养过程中菌体形态及黄原胶分泌的动态变化过程.喷涂造影显示出菌体形态及黄原胶分泌的变化规律.超薄切片揭示了此菌株的超微结构.用铬离子交联技术观察到黄原胶可交织成网状结构.     

野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖合成有关的DNA序列的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Xanthomonascampestrispv.campestris）胞外多糖突变体T117中克隆到的含有突变序列的DNA片段作探针,从野生型菌株中鉴定和克隆了含有相应序列的9．4kbHindⅢ片段。该片段可反式互补突变体T117,完全恢复其胞外多糖的合成,说明该片段至少含有一个完整的与该菌胞外多糖合成有关的基因。     

野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)L4胞外多糖的理化分析

本文报道野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campcstris)L4以蔗糖为底物在2吨发酵罐中生产的胞外多糖的理化分析结果,并与美国的商品黄单胞菌多糖(Xanthan)相比较。两种多糖纯化后单糖组分的气相色谱分析表明,它们均含有D-葡萄糖和D-甘露糖,克分子比为1：1。糖醛酸含量相同,为19％。 L4多糖和Xanthan的丙酮酸含量也相当,分别为4．23％和4.66％,元素分析和红外光谱分析表明,它们有相似的元素组成和基团吸收。L4多糖的沉降系数S02。W为11．5-11．9 S,比美国商品高(10．10S)。L4多糖的持性粘度[η]=11．8dl／g,偏比容-v=0．55ml／g,分子量为2 2 25 600—378 3000。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5 gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5 gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O-抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxc4基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的△wxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50％,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补△wxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

黄单胞菌多糖发酵中试

野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）Ｌ４在两吨发酵罐中,以蔗糖为底物发酵７２ｈ,发酵液粘度达到６０００～１２０００ｃｐ,转化率平均达到６２．４５％。     

野油菜黄单胞菌NK-01的形态及黄原胶分泌的电镜研究

利用透射电镜,研究了野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)NK-01菌株培养过程中菌体形态及黄原胶分泌的动态变化过程.喷涂造影显示出菌体形态及黄原胶分泌的变化规律.超薄切片揭示了此菌株的超微结构.用铬离子交联技术观察到黄原胶可交织成网状结构.     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定

用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc)野生型菌株8004进行诱变,分离到一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体。采用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)分析突变体的Tn5gusA5插入位点,发现其中一株编号为151D09的突变体的插入位点位于Xcc 8004菌株的基因组编号为XC3695的ORF内,该ORF功能尚未见报道。序列分析表明,该ORF演绎的编码产物与Serratia marcescens的kdtX基因和Klebsiella pneumoniae的waaE基因演绎的编码产物分别具有52%和50%的相似性,并具有第2家族糖基转移酶的功能域, 因此暂将该ORF命名为waxE基因。用同源双交换方法构建了waxE基因的缺失突变体,并采用PCR和Southern杂交的方法对突变体进行了验证。waxE基因缺失突变体在营养丰富培养基的生长繁殖不受影响,但其EPS产量与野生型菌株8004相比,降低35%左右,并且一段PCR合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补waxE基因缺失突变体,恢复缺失突变体的EPS产量,表明Xcc waxE基因与EPS的生物合成有关。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因(XC_0872)进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

黄单胞菌多糖20吨罐发酵

野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）L4在20t发酵罐中,以蔗糖为底物发酵72h,发酵液粘度达到7000～9500cp,产物对底物的转化率平均达到61．6％,为投产奠定了良好的基础。     

野油菜黄单胞菌原生质体分泌黄原胶的电镜观察

经透射电镜观察首次发现野油菜黄单胞菌 (Xanthomonascampestris)原生质体在以蔗糖为底物的高渗营养液中 ,能合成并分泌丝状黄原胶。     

野油菜黄单胞菌S—152遗传转移系统的建立及外源性内切葡聚糖酶基因在其体内的表达

通过细胞接合的方式将广宿主质粒pRK404、pKT230和RP4分别转入野油菜黄单胞菌S-152中,其转移频率均在10-4数量级上,从而建立起了S—152的转移系统．用同法将由载体质粒pRK404和白纹黄单胞菌XAI-1的CMC酶基因构成的重组质粒pND82转入到S－152中共得到了表达,使S—152（pND82）的胞内CMC酶酶活比出发菌株S-152提高了1倍．     

黄单胞菌多糖发酵中试*

野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）Ｌ４在两吨发酵罐中,以蔗糖为底物发酵７２ｈ,发酵液粘度达到６０００～１２０００ｃｐ,转化率平均达到６２．４５％。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc) 8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxcA基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的ΔwxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50%,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补ΔwxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌S-152遗传转移系统的建立及外源性内切葡聚糖酶基因在其体内的表达

(通过细胞接合的方式将广宿主质粒pRK404、pKT230和RP4分别转入野油菜黄单胞菌S-152中,其转移频率均在10-4数量级上,从而建立起了S-152的转移系统。用同法将由载体质粒pRK404和白纹黄单胞菌XA1-1的CMC酶基因构成的重组质粒pND82转入到S-152中并得到了表达,使S-152(pND82)的胞内CMC酶酶活比出发菌株S-152提高了1倍。The wide-host-range plasmid vectors pRK404 and pKT230 were transferred into a recipient strain S-152 respectively by conjugation with the aid of the helper plasmid pRK2013 at frequencies of 10-4, and a genetic transfer system for S-152 was developed. A recombinant plasmid pND82, constructed by combining the plasmid vector pRK404 with a chromosomal DNA fragment coding for CMCase from XA1-1, was introduced into S-152 by this transfer system.As a result, the intracellular CMCase activity of S-152 (pND82) increases 1 time in comparison with S-152.     

野油莱黄单胞菌两个γPON基因的突变和功能分析

广西大学生命科学与技术学院李恒聪、蒋瑞萍、姜伯乐与唐纪良(广西亚热带生物资源保护利用重点实验室)等5位科研工作者看到细菌的σ54(γPON)是一类可选择性识别启动子序列的σ因子,参与环境适应、细胞生理过程等,如氮代谢、鞭毛和菌毛的生物合成,在一些病原菌中,σ54还与致病性密切有关。为了明确σ54在野油菜黄单胞菌野油菜病变种(Xcc)中是否参与致病过程,用同源单交换定点突变方法,将Xcc 8004中的两个σ54编码基因γPON1(XC1256)和γPON2(XC2168)做单突变及双突变。其突变体表型分析结果表明:单个和同时突     

野油菜黄单胞菌中LipB-LipA是唯一的硫辛酰化途径

【目的】硫辛酸是细胞内重要的辅因子,参与多种基础代谢过程。野油菜黄单胞菌(Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原菌,在全球范围内引起植物病害,引起重大经济损失。为此研究Xcc中硫辛酸的合成途径,为防治黑腐病提供新思路。【方法】利用大肠杆菌硫辛酸合成关键酶LipA和LipB序列,同源比对发现Xcc基因组中XC_0713 (XccLipA)和XC_0712 (XccLipB)具有较高的同源性。采用PCR方法分别扩增XccLipA和XccLipB基因,并连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌突变株,并检测转化子生长表型。利用同源重组方法,获得替换突变株,分析其生长性状,并利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力。【结果】XcclipA和XcclipB能分别恢复大肠杆菌lipA和lipB突变株在基础培养上生长。XcclipA和XcclipB都是菌体生长的必需基因,不能直接被敲除。但导入pSRK-EclplA后,成功分别获得XcclipA和XcclipB敲除突变株。两种EclplA替换后的敲除突变株在基础培养上都不能生长,添加硫辛酸后能恢复生长表型。在丰富培养基上,XcclipB敲除突变株能正常生长,而XcclipA敲除突变株不能生长,添加硫辛酸后生长也能恢复。分别测定不同培养条件下生长曲线,也得到同样的结果。寄主植物侵染结果显示,与野生菌相比,XcclipA敲除突变株致病性几乎丧失,而XcclipB敲除突变株的致病性与野生菌无显著性差异。【结论】Xcc中lipA编码硫辛酸合成酶,lipB编码辛酰转移酶,两者都是必需基因。Xcc中LipB-LipA途径是唯一的硫辛酰化途径,而没有外源性的硫辛酸途径。lipA敲除后显著影响Xcc的致病性,可作为抗菌药物筛选的靶点。